[发明专利]一种低分子量肝素的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种低分子量肝素的制备方法，属生物医药领域。

背景技术

肝素是有己糖醛酸（L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸）和D-硫酸氨基葡萄糖以1→4糖苷键交替形成的粘多糖，其分子量在3000-40000Da之间，平均分子量为15000Da，肝素作为抗凝试剂和抗栓试剂已有多年的历史，此外肝素还具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌、调血脂等方面的生活功能。但是由于肝素具有抗凝血活性，所以大量的使用会引起出血和诱导性血小板减少、骨质疏松等副作用，从而大大的限制了肝素在临床上的应用。

低分子量肝素（low-molecular-weight heparin,LMWH）（.Linhardt,R.J.Gunay,N.S.Production and chemical processing of low molecular weight heparins.Sem.Thromb.Hem.25(3):5-16）是未分级肝素中具有较低分子量的组分，或肝素降解后得到的小分子组分或片段，分子量在3000—8000Da之间。与肝素相比，LMWH的抗凝作用弱于肝素，但其抗血栓作用明显强于肝素，且还具有其他优势，如分子量小，生物利用率高，体内半衰期长，按体重给药，抗凝效果可以预测，较少与血小板结合，出血倾向小。所以LMWH是一种安全有效的抗血栓药物，临床上可取代肝素。分子量均一，分布范围窄的LMWH在临床上的药效明显较好，因而在对LMWH进行质量控制方面，各国药典均规定了其平均分子量及分子量分布范围。所以，制备分子量合适且窄分布的低分子量肝素具有重要的意义。

目前，LMWH的制备方法主要有化学裂解法和酶降解法。虽然化学裂解法工艺流程较简单，但裂解过程中加入的强氧化剂会与肝素中的硫酸基团作用而引起肝素抗凝活性的降低，此外这种方法还可能引入毒物而污染环境，而酶降解法由于其温和的反应条件且无毒性易实现生产连续化而越来越得到人们的关注。美国专利（US5106734,1992）通过检测235nm处的吸光度可制备合适分子量的低分子量肝素产品。酶降解法中主要研究采用来自肝素黄杆菌（Flavobacterium heparinum）的肝素酶I来制备低分子肝素，因该酶产量低、纯化困难，造成酶的成本非常昂贵，限制了酶法制备低分子肝素的发展。于广利等（于广利，王群，管华诗，徐家敏，Robert J.Linhardt，牛肺肝素寡糖的制备，青岛海洋大学学报，2002，32（2）：231—235）利用肝素酶控制性降解牛肺肝素，得到了聚合度为2—20的寡糖纯品。邢新会等（Ye FC,Kuang Y,Chen S,Zhang C,Chen Y,Xing XH.Characteristics of low molecular weight heparin production by an ultrafiltration membrane bioreactor using maltose binding protein fused heparinase I.BIOCHEM ENG J.2009,46:193-198）利用麦芽糖结合蛋白融合表达肝素酶I，并利用所生产的酶降解肝素，得到了一系列不同分子量的低分子量肝素。这些研究虽然对肝素酶I的产量、纯化方式及制备体系都做了改进，但酶解肝素中使用的肝素酶I仍然存在一定的稳定性差的问题，造成酶的成本依然昂贵，限制了酶法制备低分子量肝素的发展。利用重组菌株生产肝素酶且在酶中添加稳定剂是降低酶成本的有效途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种采用适当的反应温度，具有较高酶活性、能够精确判断反应终点，控制低分子量肝素的数均分子量的低分子量肝素的制备方法。

本发明所提供的低分子量肝素的制备方法，是用组氨酸标签肝素酶I在一定反应温度下降解肝素，反应液经纯化即得到低分子量肝素，其特征在于：所述方法中，一定反应温度为15-40℃，所述的反应过程是在反应液的ΔA₂₃₂达到15—50时终止，所述ΔA₂₃₂是组氨酸标签肝素酶I降解肝素反应结束时反应液相比于起始时反应液的232nm吸光度的增加值。

所述方法中，所述组氨酸标签肝素酶I是利用大肠杆菌表达的带有6个组氨酸标签的重组肝素酶I，使用形式是含有二硫苏糖醇和吐温80的组氨酸标签肝素酶I冻干粉在水中重悬的溶液。