[发明专利]一种用于抑制乳腺肿瘤上皮间质转化的慢病毒重组质粒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体为一种重组质粒，通过表达目的肽段，与肿瘤转移相关蛋白发生相互作用，达到对乳腺肿瘤上皮间质转化的抑制目的。

背景技术

上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）, 即上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型的细胞，是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的核心环节。

基质金属蛋白酶（MMP）和转化生长因子TGF-β是目前已知的参与EMT的关键蛋白质。MMP是具有降解细胞外基质成分的能力，是目前已知的唯一能降解胶原纤维的酶类，其活性对细胞粘附系统的失活有一定作用。其在肿瘤生长，血管形成及肿瘤转移中发挥作用；TGF-β主要通过各整合素信号传导途径促进EMT的发生，促进Smad3分子依赖的细胞转录过程，也可以通过非Smad分子依赖的P38MAP激酶途径及GTP酶介导的信号转导途径促进EMT发生发展，在肿瘤的侵袭和转移过程中，TGF-β促使细胞周期阻滞，加速凋亡，还能诱导维持EMT状态。

Cav-1通过脚手架区（CSD区）与TGF-βI受体激酶活性区结合，抑制TGF调节Smad-2的磷酸化及其下游活动，起到激酶抑制剂的作用；CAV基因水平消除MMP2和9的表达与分泌，而且CAV过表达显著降低MMP的分泌。

发明内容

本发明提供一种用于治疗抑制乳腺肿瘤转移的重组质粒。

本发明采取的技术方案是：一种用于抑制乳腺肿瘤上皮间质转化的慢病毒重组质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。

 本发明所述的用于抑制乳腺肿瘤上皮间质转化的慢病毒重组质粒，小窝蛋白脚手架区CAV-1 CSD表达序列串联重复3次，该小窝蛋白脚手架区CAV-1 CSD编码核苷酸序列如 SEQ ID NO：3所述、氨基酸序列如 SEQ ID NO：5所述，在FuGW慢病毒质粒中泛素化启动子下，通过BamHⅠ和BglⅡ酶切位点相连。

本发明所述的用于抑制乳腺肿瘤上皮间质转化的慢病毒重组质粒，小窝蛋白脚手架区CAV-1 CSD编码核苷酸序列如 SEQ ID NO：2所述。

本发明所述的用于抑制乳腺肿瘤上皮间质转化的慢病毒重组质粒，小窝蛋白脚手架区CAV-1 CSD编码氨基酸序列如 SEQ ID NO：4所述。

本发明所述的用于抑制乳腺肿瘤上皮间质转化的慢病毒重组质粒的构建方法如下：

（一）小窝蛋白脚手架区CAV-1 CSD的表达序列片段的设计：从NCBI上获得CAV-1 CSD区的表达序列，将该段序列串联重复三次，在两端引入BamHⅠ和BglⅡ同尾酶酶切位点，根据这段序列设计用于搭接PCR的引物：

 primer1-5’: 

CAAATATTGGTTTTATCGCGATGGCATTTGGAAAGCGAGCTTTACCACCTTTACCGTGACCAAATATTG；

primer1-3’: 

GTCACGGTAAAGGTGGTAAAGCTCGCTTTCCAAATGCCATCGCGATAAAACCAATATTTGGTCACGGTA； 

primer2-5’: 

GGATCCCGCAGCGATGGCATTTGGAAAGCGAGCTTTACCACCTTTACCGTGACCAAATATTGGTTTTATCG； 

primer2-3’: AGATCTGCTGCCGCGATAAAACCAATATTTGGTCACGGTAAAGGTGGTA； 

（二）小窝蛋白脚手架区CAV-1 CSD的表达序列片段的获得：用搭接PCR的方法得到CAV-1 CSD 三次串联的序列，PCR过程使用TaqDNA聚合酶，此PCR产物两端含有单个碱基A，将其于T载体在T4连接酶的作用下进行连接，得到含有CAV-1 CSD三次串联的T载体质粒；

（三）重组质粒FuGW- CSD的构建：将步骤（二）得到的T载体质粒进行BamHⅠ和BglⅡ双酶切，BamHⅠ和BglⅡ是同尾酶，将FUGW慢病毒质粒进行BamHⅠ单酶切，PCR产物通过BamHⅠ酶切位点克隆入FUGW慢病毒质粒泛素化启动子之下。

本发明的有益效果：将CAV-1 CSD区序列进行串联重复，通过亚克隆的方法进入慢病毒质粒，构建为一个重组表达质粒FuGW-CSD；该重组质粒局部注射乳腺癌可明显抑制肿瘤癌旁基质中肿瘤相关蛋白的活性。FuGW-CSD重组质粒局部注射乳腺癌可明显抑制其上皮间质转化，抑制其转移。填补目前没有局部注射抑制乳腺肿瘤转移、发展的重组质粒的空白。

附图说明