[发明专利]三种木蝴蝶苷在制备抗金葡菌感染药物中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及三种木蝴蝶苷在制备抗金葡菌感染药物中的应用，属于医药领域。

背景技术

这三种木蝴蝶苷(Oroxin A, Oroxin B, Oroxylin A 7-O-glucuronide)是从紫葳科植物木蝴蝶 的干燥成熟种子中分离出的三种天然黄酮类化合物，在草莓、葡萄、苹果、洋葱等蔬菜和果实中也有存在。具有明显的抗氧化、抗炎特性，对免疫系统还有一定的调节作用，但目前为止国内外未见漆黄素用于抗金葡菌感染的报道。

金黄色葡萄球菌是临床最常见的条件致病菌之一，超过50%的成年人体内都携带金葡菌，其中10-20%的人群永久定殖。金葡菌除引起人的局部毛囊炎、疖肿、蜂窝织炎外, 还可以引起肺炎、心包炎、骨髓炎、肾盂肾炎、肾脓肿等多种化脓性疾患以及菌血症、心内膜炎等危及生命的疾病，具有非常高的发病率和死亡率，如由金葡菌所致全身感染的病死率高达50%以上。近年来，抗生素的大量使用导致细菌耐药率增高，已经发现多种临床分离株对四环素和环丙沙星等抗生素耐受严重，造成金葡菌菌病的治疗面临无药可治的局面。因此，寻找新型、安全的治疗药物迫在眉睫。这三种木蝴蝶苷来自于我国传统中药，本发明研究证实了这三种木蝴蝶苷对抗金葡菌感染具有较好的治疗效果。

发明内容

分子结构如下：

                                                 

本发明通过羊红细胞溶血试验、小鼠巨噬样细胞J774和小鼠腹腔巨噬细胞损伤的保护试验以及小鼠金葡菌感染模型证实其抗金葡菌菌感染作用。

附图说明

图1. 不加木蝴蝶苷和加入不同浓度的木蝴蝶苷后α-溶血素的溶血滴度。

图2. 三种木蝴蝶苷结合。

具体实施方式

溶血试验

纯化的金葡菌α-溶血素于96孔板中作连续的二倍稀释，每个孔中加入10⁷个羊红细胞，于37℃中孵育30h后离心。使红细胞溶解的最高稀释倍数视为溶血滴度（Hemolysis titre），如图1所示。

应用分子动力学模拟方法对木蝴蝶苷抗金葡菌α-溶血素活性位点确证

2.1 应用分子动力学模拟方法确证活性位点

(1) 分子对接 (molecular docking)

为了初步确定木蝴蝶苷与α-溶血素结合位点，以及木蝴蝶苷与α-溶血素分子间结合能力强弱，首先进行木蝴蝶苷与α-溶血素的分子对接，初步确定木蝴蝶苷与α-溶血素复合物的结构。

(2) 分子动力学模拟 (Molecular dynamics simulations)

运用分子动力学模拟研究α-溶血素分子和它的突变体与木蝴蝶苷间结合能的变化，结合构象分析方法分析α-溶血素蛋白构象变化，特别是结合木蝴蝶苷底物的结合区域的构象变化。确定木蝴蝶苷与α-溶血素蛋白结合活性位点。

(3) 定点残基突变（Site-directed mutagensis）

根据分子模拟的结果，找到在木蝴蝶苷与α-溶血素蛋白结合中关键作用氨基酸残基。应用分子生物学方法，对α-溶血素进行定点残基突变，分别克隆表达出野生型和突变体的α-溶血素蛋白。

(4) 荧光淬灭法测定蛋白质与木蝴蝶苷的结合常数

    将木蝴蝶苷与α-溶血素蛋白（野生型和突变体）相互作用后，应用荧光淬灭法测定α-溶血素与木蝴蝶苷的结合常数，并与动力学模拟的结果相比较，确定木蝴蝶苷与α-溶血素相互作用的作用靶点。

2.2 机制分析

根据结合自由能计算及能量分解，分析结合区域关键氨基酸残基的构象变化，找出影响木蝴蝶苷与α-溶血素蛋白结合能力专一性和大小的因素，最终确定α-溶血素蛋白与木蝴蝶苷复合物构象变化与药效间的联系。

2.3 实验确证

应用脱氧胆酸诱导的α-溶血素寡聚化试验验证木蝴蝶苷抗α-溶血素的作用机制。

结果表明，这三种木蝴蝶苷均可以结合于α-溶血素stem区域，抑制其从单体到多聚体的构象变化，从而抑制α-溶血素的溶血活性，如图2所示。

三种木蝴蝶苷对由金葡菌α-溶血素介导的人肺上皮细胞（A549）损伤的保护试验

在金葡菌与A549细胞共培养体系中加入不同浓度的木蝴蝶苷进行共培养，然后进行以下试验考察木蝴蝶苷对α-溶血素介导的A549损伤的保护作用。