[发明专利]果蝇肠道免疫相关基因的筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于果蝇天然免疫领域，本发明涉及一种筛选果蝇肠道免疫相关基因的方法。

背景技术

肠道粘膜除具有消化吸收功能外，还是内部与外部环境之间的一种屏障，能够保护宿主免受病原微生物的入侵，同时也是菌群与宿主免疫系统的调节者。当受到外界环境的不断地刺激时，肠道上皮细胞会对内部和外部因子作出应答进而确保它们自身的生存及适当的肠道内环境。近年来，越来越多的人受到肠道炎症疾病的困扰，而且长时间的炎症及组织损伤将导致肠道的癌变及肿瘤的形成。虽然人体可通过天然和获得性免疫来抵抗肿瘤，但现实条件下由于广泛的免疫逃逸机制的存在，肿瘤极少能自然消退。因此，阐明肠道上皮细胞与多种微生物之间的相互作用及共生菌群参与宿主胞内信号通路的调节机制对于肠道疾病的治疗具有重要的指导意义。

果蝇作为一个经典的实验模型已逐渐地应用于肠道免疫的研究，一些重要的影响肠道免疫的信号通路已经建立，近几年的研究热点主要集中在ROS（活性氧）及局部AMPs（抗菌肽）的产生，这两种重要的互补效应机制控制着肠道微生物的感染。在果蝇肠道中，NADPH氧化酶DUOX参与产生的ROS为抵抗微生物的入侵提供了有效的保护屏障，而IMD(Immune deficiency)信号通路诱导的局部AMPs的表达在肠道免疫中也发挥了重要的作用。同时为避免长时间过度的免疫反应，果蝇肠道会通过多种调节机制来限制IMD通路的活性及ROS的产生，这些保护机制也是维持共生菌及非病原菌生长所需要的条件。此外，肠道干细胞（ISCs）能通过增殖和分化来修复由微生物感染引起的肠道上皮细胞的损伤，而调节果蝇肠道干细胞分化的调节机制也正逐渐被阐明。已知肠道干细胞的分化受多种信号通路的调节，主要包括:Notch、Wnt、BMP(Bone Morphogenic Protein)、MAPK(Mitogen-Activated Protein Kinase)、JAK-STAT(Janus Kinase and Signal Transducer and Activator of Transcription)等信号途径。有研究发现，损伤的肠细胞能分泌细胞因子Upd3，它能够激活JAK-STAT信号通路，进而促进肠道干细胞增殖及上皮细胞再生，同时发现JNK(c-Jun N-terminal Kinases)途径也能对微生物感染引起的肠道损伤作出免疫应答。而Hippo信号通路能通过抑制JAK-STAT和EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)信号通路的激活因子来负调控肠道干细胞的分化。

果蝇与人类的肠道具有相似的结构和功能，肠道干细胞的分化机制也十分相似，同时癌基因与肿瘤基因在果蝇与人类之间也是高度保守的，因此阐明果蝇肠道免疫调节机制及肠道干细胞分化机制对揭示人类肠道相关疾病的发病机制具有重要的指导作用。然而，尽管近年来果蝇模型已为肠道免疫的研究提供了大量的信息，但一些重要的问题仍有待解决，例如，肠道上皮细胞区分共生菌群与病原菌群的机制还未被阐明，共生菌群诱导的NF-κB活性与ROS的基础性表达对宿主的意义也尚不清楚，一些重要信号通路的调控因子还未被发现。因此，本领域有必要开发一种系统且高效的筛选果蝇肠道免疫基因的方法，从而有利于研究者更好的理解复杂的肠道免疫调节机制，同时也为治疗肠道疾病提供新的思路。

发明内容

本发明的目的在于提供一种初步筛选果蝇肠道免疫相关基因的方法，该方法通过给基因突变体果蝇喂食不同种类的微生物（Micrococcus luteus和Beauveria bassiana孢子）、过氧化物（H₂O₂）、高盐离子（NaCl）以及表面活性剂（SDS）后，观察突变体果蝇生存率，肠道的形态变化及细胞凋亡，从而能够简便、快速的初步筛选出与果蝇肠道免疫相关的基因。

本发明所采用的技术方案包括如下步骤：

（1）突变体果蝇的获得

在果蝇保种中心网站上查找并购买所感兴趣的基因突变体果蝇

（2）生存率实验中喂食果蝇所需菌液及化学试剂溶液的配制方法：

1）Micrococcus luteus菌菌液的配制：将保种Micrococcus luteus菌菌液按1:100比例接种于LB液体培养基中，37℃振荡过夜培养后测其OD₆₀₀值，离心后收集菌体沉淀，在菌体沉淀中加入蔗糖并用去离子水定容，使Micrococcus luteus菌菌液终浓度达到OD₆₀₀=150，蔗糖的终浓度为5%。