[发明专利]一种高产花生四烯酸的高山被孢霉突变株及发酵方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术，微生物工程和油脂工程的领域，具体涉及一种高产花生四烯酸的高山被孢霉突变株，还涉及该突变株的制备方法，还涉及该突变株的制备花生四烯酸中的应用。

技术背景

一、ARA的生理活性及市场

当今世界需解决因人口增长而带来的市场不足的难题。除增加粮油食品、肉类、蔬菜等的产量外还可通过生产人类必需且有生理活性的物质，提供人们摄食，从而减少人类对农产品的依靠，这就是在世界范围内掀起的第四代功能性食品即有效成分和生理功能清楚的功能性食品。我们研究的包括ARA、DHA、GLA等含不饱和脂肪酸（Poly unsaturated fatty acids，PUFAs）的油脂和油溶性β-carotene就是风靡世界的第四代功能性食品。尤其是1990年人们在母乳中发现了ARA和DHA两种PUFAs，这两种PUFAs是大脑中最主要的脂肪酸组成，如果加强这两种脂肪酸，将会对孕妇和新生儿有特殊的好处。ARA在人体血液、肝脏、肌肉和其它器官中，作为与磷脂结合的结构脂类作用，ARA还是PGE₂、PGI₂、TXA₂、LTB₄和LTC₄等的活性生物物质的前体，这些活性物质对脂蛋白的代谢、血液流变学、血管弹性、白细胞功能和血小板激活等具有很好的调节作用，ARA对婴幼儿的神经层尤其是大脑的生长发育至关重要，在人体脑和神经细胞中，ARA占其PUFAs的40～50%，在神经末梢甚至高达70%，因而在WHO要求在婴幼儿奶制品中加入ARA。ARA作为营养强化剂、化妆品添加剂、保健品、化工原料、生物饲料和生物制药等。我国仅奶粉一项，ARA的用量就达100吨，3～5亿元。在欧美国家推出了孕妇处方中只含10%ARA。就将拥有巨大的市场。

二、ARA及其产生菌

ARA是ω-6系列多不饱和脂肪酸（PUFAs），分子式C₂₀H₃₂O₂，其分子中含有四个双键，故亦极易氧化和酸败，稳定性欠佳。其熔点仅为-49.5℃，沸点为245℃。微生物产生的ARA为金黄色油状物，溶于醇、醚、水等。ARA在苔藓类和蕨类、沙丁鱼油中检测到，但含量极低，没有大规模开发价值。在微藻中，部分细菌也产生ARA，但产生率极低并生产较为困难。因而目前在研究和工业中应用较多的产ARA的微生物是丝状真菌，如被孢霉（Mortierella），毛霉属(Mucor)，根霉属（Rhizopus）等，尤其是高山被孢霉（M.alpina）成为工业化生产的主要菌种。

三、ARA及其安全性

3.1ARA产生菌的安全性

高山被孢霉（Mortierella alpina）属于接合菌纲毛霉目（或被孢霉目）被孢霉科被孢霉属。至今没有文献报道被孢霉属菌产生特异性毒素，研究结果表明，目前没有任何文献表明被孢霉有毒性。M.alpina正常是从温带土壤中分离，所以人体很容易处在该菌孢子的坏境中，考虑到生产人员的安全，对温血动物的变应原特别重要。据研究，结论是大部分M.alpina（尤其是ARA生产株）没有显示出对温血动物的潜在变应原性。因为ARA生产中全是液体发酵，仅有固体平板生产菌种，据我们的研究不产分生孢子和少量分生孢子的M.alpina的菌株产ARA的量高。因而生产人员和最终消费人员几乎不可能接触到孢子。从这个方面看，M.alpina的生产株不具有变应原性。

由高山被孢霉发酵生产的ARA油脂，经欧洲食品安全局（EFSA）对SUN-TGA40S ARA产品的急性毒性、慢性毒性研究。研究结果表明其是安全无毒的。中国、美国、日本等国也对M.alpina生产的ARA油脂进行安全性研究也证明是安全无毒的，我国已发布在2010年第3号文件中，公布了ARA为新资源食品。

3.2ARA油脂的安全性

欧洲食品安全局(EFSA)[11]对SUN-TGA40S（AA含量＞40%）的进行了急性毒性研究，以单剂量2g/（kg体重）喂养五只雄性ICR小鼠，观察14天后进行解剖，试验观察中没有小鼠死亡，并且没有迹象表明SUN-TGA40S有毒性。

3.2.1慢性毒性