[发明专利]一种对虾白斑症病毒双抗体夹心ELISA检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种病毒检测试剂盒，特别涉及一种用于检测对虾白斑症病毒（WSSV）的双抗体夹心ELISA试剂盒，属于免疫学和病毒学交叉技术领域。

背景技术

对虾白斑症病毒（WSSV）为线形病毒科（Nimaviridae）白斑病毒属（whispovirus）唯一的成员，是一种具囊膜、杆状的双链DNA病毒，可广泛感染虾、蟹等十足类甲壳动物。WSSV主要侵染皮下组织、造血组织、结缔组织、淋巴器官等，受感染的组织细胞核肿大，患病对虾典型症状是甲壳内侧具有大小不等的白色斑点，头胸甲易被剥离。对虾一旦感染该疾病，数天内死亡率可达100%，使对虾养殖业遭到极大的损失。该病自上个世纪90年代开始流行于亚洲地区，并迅速蔓延至欧洲乃至全世界，给世界对虾养殖业带来了严重灾难。目前该病缺乏切实有效的治疗手段，因此建立WSSV快速、准确、简便、灵敏、可定量的检测方法，及时掌握养殖虾、蟹类感染WSSV的严重程度，并积极采取相应的预防措施，对指导养殖生产具有重要意义。

目前常用的WSSV检测方法有普通PCR、胶体金免疫层析试纸条和酶联免疫法、实时荧光定量PCR等。普通PCR灵敏度较高，但是操作复杂，不能定量检测；胶体金免疫层析试纸条能够在几分钟内得到检测结果，但是其灵敏度不高，且不能定量检测；实时定量PCR的灵敏度很高，能够定量检测，但其设备昂贵、操作复杂。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种特异性强、灵敏度高、操作简便、快速可定量的WSSV双抗体夹心ELISA检测试剂盒。

本发明的另一个目的是提供用于上述双抗体夹心ELISA检测试剂盒的单克隆抗体，以及提供利用所述检测试剂盒检测对虾白斑症病毒的方法。

本发明的检测试剂盒包括：包被捕获抗体的酶标板，封闭液，洗涤液，碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG抗体、底物显色液，终止液以及检测抗体。

所述捕获抗体是兔抗WSSV多抗。

所述检测抗体鼠抗WSSV单抗。

所述封闭液是含质量体积比为3.0%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。

所述洗涤液是含质量体积比为0.1% Tween-20的磷酸盐缓冲液。

所述底物显色液是对硝基酚磷酸二钠（PNPP）底物显色液，其含1mg/m的pNPP、0.5mol/L的氯化镁以及体积比为10%的二乙醇胺。

所述终止液是2 mol/L的NaOH水溶液。

所述作为捕获抗体的兔抗WSSV多抗的制备方法如下：

将纯化的WSSV与弗氏完全佐剂充分混匀后，皮下多点注射新西兰大白兔；2周后将WSSV与弗氏不完全佐剂混匀，皮下多点注射进行加强免疫；接下来每隔1周进行1次加强免疫，采用皮下多点注射提纯的WSSV；第3次加强免疫后6天收集抗血清，兔抗血清经过辛酸-硫酸铵法纯化后即为捕获抗体。

所述作为检测抗体的鼠抗WSSV单克隆抗体由名称为：杂交瘤细胞WSSV-3B7，保藏编号为CCTCC NO: C201398，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2013年06月24日的杂交瘤细胞分泌所得。

在倒置显微镜下观察，生长状态良好的该杂交瘤细胞分裂旺盛、外观饱满、浑圆、折光性强、细胞大小均一、贴壁良好；该杂交瘤细胞有无限分裂增生能力；长势良好的该杂交瘤细胞常规培养2-3天，其培养基由桃红色转变为黄色，该培养基中含有该杂交瘤细胞分泌的大量的抗WSSV单克隆抗体。

利用所述WSSV双抗体夹心ELISA检测试剂盒检测对虾白斑症病毒的方法，其步骤如下：

（1）加待检样品：取试剂盒中包被有捕获抗体的酶标板，向其中加入经过处理的待检样品，每孔100 μL，每个样品3个重复，37 ℃孵育1 h；

（2）检测抗体孵育：弃去板内液体，洗涤酶标板，每孔加入100 μL检测抗体，37 ℃孵育1 h；

（3）酶标二抗孵育：弃去板内液体，洗涤酶标板，每孔加入100 μL碱性磷酸酶标记羊抗鼠IgG抗体，37 ℃孵育1 h；

（4）显色与OD测定：弃去板内液体，洗涤酶标板，每孔加入200 μL底物显色液，37 ℃条件下孵育发色15 min，每孔加入50 μL 2 mol/L的NaOH溶液终止反应，用酶标仪测定OD₄₀₅值；