[发明专利]表达IBV S1和N双抗原蛋白重组质粒及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于动物医药生物工程研究领域，尤其涉及一种表达IBV的S1和N双抗原蛋白重组质粒及其构建方法和应用。 

背景技术

鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis，IB）为国际兽医局及我国规定的家禽二类传染病之一，是目前分布最广泛、发病最普遍的疫病之一。该病是由鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触传染性的呼吸道疾病，不同日龄、性别、品种鸡均可易感。IBV主要侵害鸡的呼吸道、肠道、输卵管及肾脏，可引起相应器官的病变和损伤，更重要的是容易引起细菌及其它病原的继发感染，引起更大的损失，是造成目前生产上最普遍而且危害最大的鸡呼吸道综合症的重要病因之一。由于IBV在鸡群中感染的广泛性和普遍性，加之病毒基因组RNA复制过程的不连续性以及RNA聚合酶的不完全校对机制，造成其基因组十分容易发生点突变、缺失、插入和不同毒株基因组间的同源重组，使得病毒的血清型、基因型、致病性、免疫原性等极易发生变异，因而病毒临床表现复杂、血清型众多，而各血清型之间仅有部分或完全没有交叉保护作用，从而给本病的免疫防控带来很大的困难。 

IBV有三个主要结构蛋白，即纤突（S）蛋白、膜（M）蛋白、核衣壳（N）蛋白。S蛋白由S1和S2两个糖蛋白亚基组成，其中S1糖蛋白是IBV蛋白中变异程度最大的结构蛋白，系IBV的主要保护性抗原和致病相关基因，IBV的抗原性和致病性的改变主要与S1基因的变异有关。S1基因5'端起始密码后第159～444nt处存在一个高变区（HVR），在HVR内第330～357nt处又存在一个所谓的相对保守处，因而将HVR分隔为上游的HVR I和下游的HVRⅡ。大多IBV血清型抗原决定簇位于S蛋白的S1亚单位的N端，即S1的前300个氨基酸残基内。那些遗传起源接近血清型不同的毒株大多可从HVR区编码的抗原簇表位的差异得到反映。N蛋白位于病毒的内部，相对于S1基因而言则比较保守，它在病毒复制及组装过程中具有重要作用，而且具有很好的免疫原性，在体内可诱导产生高水平的抗体并介导细胞毒性T细胞效应（CTL）。防控IB的关键在于避免早期的感染，这样能大大减少IBV对鸡体的侵害。 

疫苗预防仍是控制IB的最有效措施之一，针对IB病毒的基因变异与血清型变化，怎样使用疫苗来有效预防该病是我们当前迫切要解决的难题。现有的研究针对载体和佐剂的 单基因疫苗居多，研制能产生高的特异性细胞免疫和体液免疫且广谱的新型疫苗仍是当前研究的难点和热点。DNA疫苗具有一般重组病毒活载体疫苗抗原合成和提呈及类似自然感染的优点，其在安全性和有效性上具有突出的优点而且可以将多个抗原基因构建在同一表达载体上形成多价疫苗。但是，常规DNA疫苗的免疫原性较传统疫苗弱，主要原因是大部分质粒在未发挥作用之前就降解了，而且表达的蛋白只有小部分能达到靶器官发挥免疫诱导作用。针对此问题，提高DNA疫苗效果的一个令人振奋的途径是DNA疫苗的靶向策略，即将DNA疫苗或其表达的蛋白产物定向于抗原递呈细胞（APC），特别是树突状细胞（DC）。APC内部靶向策略之一就是增强MHC-Ⅰ类途径，使用微小基因疫苗将抗原表位直接转运进内质网。 

泛素（Ubiquitin，Ub）是由76个氨基酸组成，高度保守，普遍存在于真核细胞内的小分子多肽。泛素及其对蛋白质的标志修饰（泛素化，ubiquitination or ubiquityrmtion）参与细胞内ATP依赖的选择性蛋白质降解过程，泛素-蛋白酶体途径的发现，引起了研究者的广泛关注。研究表明，26S蛋白酶体与主要组织相容性复合物（MHC）限制性类抗原的处理有密切关系，泛素-蛋白酶体途径是MHC-Ⅰ限制性类抗原提呈所必需的环节。Ub可通过共价键结合将外源性抗原转化为内源性抗原并促进内源性抗原在胞浆内的降解，有利于使抗原导向到蛋白酶体中，并且加速它的循环及通过MHC-Ⅰ类途径的递呈。近年来，国内外已有学者利用泛素来提高DNA疫苗的免疫效果，研究结果表明Ub融合质粒DNA能够诱生较强的细胞免疫反应。目前关于泛素增强禽类病原免疫应答研究报道甚少，尤其是针对病毒抗原的研究还未见报道。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种表达IBV的S1和N双抗原蛋白重组质粒及其构建方法和应用。 

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：表达IBV的S1和N双抗原蛋白重组质粒，主要由鸡传染性支气管炎病毒的S1、N基因、鸡的Ub基因和真核表达载体pVAX1组成。