[发明专利]一种pH稳定比酶活高的重组碱性果胶酶及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种pH稳定性、比酶活得到提高的重组碱性果胶酶和其编码基因，及其构建方法，属于生物遗传工程技术领域。 

背景技术

果胶酶是分解果胶质的多种酶的总称。果胶酶按其作用最适pH 分为酸性果胶酶和碱性果胶酶。酸性果胶酶的酶作用最适pH在偏酸性范围，广泛应用于果汁和酒类的提取以及饲料工业（邬敏辰，2006）。碱性果胶酶的酶作用最适pH在8.0-10.0，目前在植物药提取、茶和咖啡发酵、油提取，纺织、造纸、洗涤剂、植物纤维加工、含果胶工业废水处理及生物技术等行业的应用越来越受到重视，所以成为人们研究的热点（Jayani RS，et al. Process Biochemistry 40 ：2931-2944，2005）。 

果胶酶可来源于植物和微生物，但植物天然来源的果胶酶产量低且提取困难，难以大规模制备；微生物具有生长速度快、生长条件简单、代谢过程特殊和分布广等特点（华宝玉等， 2012），易于进行基因改造，为果胶酶的广泛工业化应用打下坚实基础。 

本发明前期研究的碱性果胶酶基因pel168来源于Bacillus subtilis 168，含有1263bp的开放阅读框，编码420个氨基酸，通过SignalP分析，显示该氨基酸序列含有21个氨基酸的信号肽。将该基因pel168在大肠杆菌中进行了表达，表达所得果胶酶PEL168经纯化后进行酶学性质的研究表明，该酶的最适温度为50°C，最适PH为9.4。但是，这种碱性果胶酶在pH为3～6时，相对活性降低40%，并且比酶活也较低（Chengjie Zhang et al, BMC Biotechnology，2013）。 

在工业化应用中，酶的pH适应范围窄将需要更多的技术来维持反应体系中pH的稳定，同时需要大量的酸或碱来中和，就造成成本高、用水量大、能耗高、耗时长，废液中COD值高等问题，同时果胶酶的高效性，多用性的研究也迫在眉睫。因此，获得更加高效、多用、稳定的果胶酶，就成为更好的研究开发与应用果胶酶的关键。 

发明内容

本发明的目的是提出一种pH稳定性、比酶活较高的重组碱性果胶酶及编码基因，及其构建方法。. 

本发明是这样实现的。在GenBank 收录号AL009126中含有的果胶酶基因pel168，对应果胶酶PEL168的氨基酸序列收录号为CAB12585.1，设计点突变引物（FP和RP）进行定点诱变，将公布的基因457位的鸟嘌呤G变成胸腺嘧啶T，获得pel168V132F，使得其编码氨基酸序列成熟肽的第132位的缬氨酸V（GTC）突变成苯丙氨酸F(TTC)，获得重组碱性果胶酶PEL168V132F。

V132F,氨基酸序列具体如下 

1    ADLGHQTLGS  NDGWGAYSTG   TTGGSKASSS   NVYTVSNRNQ  LVSALGKETN

51   TTPKIIYIKG    TIDMNVDDNL   KPLGLNDYKD   PEYDLDKYLK   AYDPSTWGKK

101  EPSGTQEEAR  ARSQKNQKAR   VMVDIPANTT   IFGSGTNAKV   VGGNFQIKSD

151  NVIIRNIEFQ   DAYDYFPQWD   PTDGSSGNWN  SQYDNITING   GTHIWIDHCT

201  FNDGSRPDST  SPKYYGRKYQ    HHDGQTDASN  GANYITMSYN  YYHDHDKSSI

251  FGSSDSKTSD   DGKLKITLHH    NRYKNIVQRA   PRVRFGQVHV  YNNYYEGSTS

301  SSSYPFSYAW   GIGKSSKIYA    QNNVIDVPGL   SAAKTISVFS    GGTALYDSGT

351  LLNGTQINAS   AANGLSSSVG   WTPSLHGSID   ASANVKSNVI   NQAGAGKLN*

G变T,DNA序列如下

1  atgaaaaaag  tgatgttagc  tacggctttg  tttttaggat  tgactccagc  tggcgcgaac