[发明专利]一种Clec3b基因敲除打靶载体

说明书

技术领域

本发明涉及一种条件基因敲除重组载体，尤其涉及一种用于构建敲除Clec3b基因小鼠模型的重组载体、以及所述载体的构建方法。

背景技术

四连接素（tetranectin，TN）于1986年在人类血浆中被发现，是凝集素家族C型成员之一，其分布十分广泛，见于多种组织和细胞中。除了人类，在猴、马、猫、猪、牛、狗、鼠、羊、鱼、爬行动物、两栖动物等动物中也发现TN蛋白的存在，说明TN在动物的生长发育过程中起重要的作用。

TN在血浆中被发现不久，即被发现与多种疾病、尤其是恶性肿瘤有关，如乳房癌、结肠癌、卵巢癌、冠心病、风湿性关节炎、多发性硬化、老年性痴呆、帕金森病等。研究显示，在恶性肿瘤患者血清中，TN呈低水平表达，但是在肿瘤组织中却高表达；还有研究证实，TN在帕金森病患者脑脊液中显著下调，因此可能参与了帕金森病的发生，有可能成为帕金森病的生物标记物。

虽然关于TN的研究已展开30年，但是，至今为止，TN的生理作用并不清楚。根据目前研究，一般认为TN的作用是通过它与纤溶酶原的结合来完成的。TN编码基因（Clec3b）含三个外显子，二个内含子，每个外显子都编码其特有的功能区域，其中外显子3编码的CRD区可能是TN与纤溶酶原结合的主要部位。但是，是否受其他区域影响则不清楚。目前TN领域的研究成果非常有限，因此深入研究TN的作用机理，对进一步研究肿瘤等疾病的发生机制和治疗方法具有十分重要的意义。

但是目前研究TN作用机理的动物模型非常匮乏，国外文献（至今总共发现2篇基因敲除的研究文献，且为同一机构报道）有报道通过敲除外显子3的方式获得TN敲除的小鼠模型，但是，这种方法仅消除了TN的部分功能，尚不能充分说明TN的功能是否完全消除。研究发现TN外显子3敲除后，可引起小鼠的脊椎发育出现畸形以及伤口愈合出现延迟，可是，报道的2篇文献均未能解释、也无法确认是否通过影响TN与纤溶酶原结合而导致这些现象的出现。因此，仍然需要研发完全消除TN功能的动物模型，以更好的在TN领域展开研究。

发明内容

针对目前TN基因研究模型存在的缺陷，本发明提供了一种能够构建敲除Clec3b基因小鼠模型的重组载体，所构建的小鼠模型克服了背景技术所述小鼠模型的缺点，通过敲除外显子1以及其上游的启动子，使整个TN蛋白无法表达，真正完全消除了TN的功能。这种小鼠模型的建立对研究TN的功能既提供了便捷又提供了保证。

本发明第一个方面是提供一种Clec3b基因敲除打靶载体的构建方法，所述方法包括：

在Clec3b基因外显子1的前后各引入一个loxP位点，其中，一个为独立的loxP位点，另一个带有Neomycin标记（Neo）；通过重组导入载体中。

本发明第一个方面所述的方法的一种优选实施例中，设计5’同源臂（5’arm）和3’同源臂（3’arm）引物P1-P4如下：

P1：5’-GGGCGGTGCTCTTTCCATTAGTT-3’

P2：5’-CTGAGCCCAGAAAGCGAAGGA-3’

P3：5’-GTGCCACTCCCACTGTCCTTTCC-3’

P4：5’-TTCCTCTGTGACTGGCCCGACTCC-3’

其中，P1和P2扩增2.7kb的5’同源臂，P3和P4扩增3.8kb的3’同源臂。

本发明第一个方面所述的方法的一种优选实施例中，所述方法步骤为：

PCR扩增5’和3’同源臂，BAC转化至EL350，进行同源重组；

在第一个位置插入floxP-Neo-loxP片段；然后切除loxP位点的floxed Neo标记，余下一个loxP；

在第二个loxP位置插入loxP/FRT-NeFRT片段，构建完成。

本发明第二个方面是提供一种上述方法构建的Clec3b基因敲除打靶载体。

本发明提供的重组载体，通过小鼠胚胎干细胞基因打靶、药物筛选、挑取阳性克隆、PCR鉴定获得同源重组克隆，将正确同源重组的胚胎干细胞通过囊腔注射获得嵌合体子代，嵌合体子代通过与野生型杂交后获得杂合子，杂合子之间进行杂交繁育即获得纯合子。

本发明所述载体通过敲除外显子1以及其上游的启动子，使整个TN蛋白无法表达，真正完全消除了TN的功能。这种小鼠模型的建立对研究TN的功能既提供了便捷性，同时又提供了研究准确性的保证。

附图说明

图1为本发明Clec3b基因条件敲除打靶载体构建策略示意图；