[发明专利]六味地黄制剂中葡萄糖二酸盐及葡萄糖二酸1,4内酯含量测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及药物分析领域，特别涉及六味地黄系列制剂中葡萄糖二酸盐及葡萄糖二酸1，4内酯的含量测定方法。

背景技术

六味地黄丸由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮、茯苓等6味中药按一定的比例配伍而成，已有几百年的临床应用历史，是中医药的经典名方。随着临床研究的不断深入,其主治亦由原来的儿科用药拓展到内、外、妇、儿、五官等各科,涉及病症已达40 余种，特别对复杂慢性疾病等有较好的疗效。由于该成药疗效确切，几乎没有不良反应报道，且价格低廉等因素，深受大众青睐。目前，在国内约有上百家厂家生产六味地黄产品，主要有汤剂、丸剂、口服液和胶囊剂等；有几十个六味地黄品牌，年销售额超过10亿元，有着良好的社会效益和经济效益。

应用化学和药理相结合、血清药物化学等方法对六味地黄丸的药理活性成分，入血及体内代谢成分等进行了较为深入的研究，分离制得了一些有生物活性的多糖或小分子代谢产物，取得了可喜的成绩。代谢组学(metabonomics)是继基因组学、转录物组学和蛋白质组学后出现的新的‘组学’技术，主要对生物体在病理生理刺激的条件下,在不同时间、多方位定量检测其代谢物含量的变化,来探讨干预物对机体的调控机制的学科。近年来，代谢组学在发现与疾病诊断、治疗相关的代谢标记物研究、药物药效及毒性评价、作用机制等方面均有着广泛的应用，显示出巨大的潜力。我们在基于HPLC-UV代谢组学特征色谱峰鉴定的基础上，通过对4个特征色谱峰的相对变化关系，推测六味地黄丸可能影响大鼠体内β-葡萄糖醛酸苷酶的活性。经体内外实验证实六味地黄丸具有明显的β-葡萄糖醛酸苷酶抑制作用，从而发现了六味地黄丸的一个作用靶点——β-葡萄糖醛酸苷酶。在此基础上，通过逐步分离六味地黄丸化学成分及体外酶活性测定相结合的方法，发现和鉴定了六味地黄丸中的一种新的药理活性成分－葡萄糖二酸1，4内酯。文献研究（Charles B.S.,Journal of Orthomolecular Medicine Vol. 16, No. 2, 2001）表明该物质（包括其前体葡萄糖二酸盐）具有广泛的包括抗癌及雌激素相关的药理作用，之前，该化合物未有在中草药中被发现的报道，因此，未有葡萄糖二酸盐及其内酯在中草药含量测定方法的报道。

虽然葡萄糖二酸盐被发现存在于水果如苹果和葡萄及少量的蔬菜中，迄今为止，未见利用HPLC-HILIC-UV/ELSD及HPLC-MS/MS技术对他们进行定量测定的报道。

发明内容

本发明的主要目的是对六味地黄系列制剂中的新发现成分葡萄糖二酸盐及葡萄糖二酸1，4内酯应用多种分离检测技术如HPLC-HILIC-UV/ELSD/MS进行定量分析。

葡萄糖二酸盐及葡萄糖二酸1，4内酯结构式如下：

本发明具体方案如下：

称取一定量的六味地黄制剂，加入一定体积的60%甲醇溶液，超声20min，离心，沉淀再用等体积上述溶液提取一次，离心，合并上清液；所得上清液直接用 MS或HPLC-MS技术进行分析；葡萄糖二酸盐特征分子负离子离子峰为209，191，85；葡萄糖二酸1，4内酯特征分子负离子离子峰为191，85；色谱保留时间、质谱图与标准品一致。

六味地黄制剂中葡萄糖二酸盐及葡萄糖二酸1,4内酯含量测定方法，包括：

1）葡萄糖二酸盐和葡萄糖二酸1，4内酯标准溶液的制备：分别精密称取葡萄糖二酸盐和葡萄糖二酸1，4内酯两种对照品40.0mg，定量转移至10.0mL容量瓶中，加水稀释到刻度，精密移取5.0mL至10.0mL容量瓶中，加80%乙腈稀释至刻度，配制成200.0ug/mL溶液，作为对照品母溶液；

2）HPLC-HILIC-UV/ELSD法测定六味地黄丸中总葡萄糖二酸盐的含量：