[发明专利]以二氧化钛为固相对样品中核苷的萃取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种以二氧化钛为固相对正常核苷（腺苷、胞苷、尿苷、尿苷）的萃取方法，属于样品预处理技术。

背景技术

DNA/RNA的修饰与人体的各项生理过程息息相关，对其的研究一直是相关学科的重点。而在体内，由于正常核苷的丰度较高，容易干扰2’-脱氧核苷及2’-O修饰的核苷的检测。在分析2’-脱氧核苷前，通常采用预酶解RNA、沉淀DNA的步骤以降低最终样品中正常核苷的含量。而这种酶解法包含一系列多步处理过程（如RNase酶酶解、苯酚/氯仿溶液萃取、异丙醇低温沉淀、清洗复溶等），需要近12个小时的处理时间。另外，频繁的样品转移与溶剂交换导致样品回收率降低、重现性变差。而且，实际上，该方法去除核苷的效率并不高。另外，对于分析2’-O修饰的核苷，目前还未出现有效去除水解RNA时共生成的正常核苷的手段。

二氧化钛是一种常见的金属氧化物材料，价格低廉、用途广泛。这类材料对于含有顺式羟基结构的物质具有独特的亲和能力，相关研究一直是光催化领域的热点。相对于2’-脱氧核苷及2’-O修饰的核苷，正常核苷戊糖基团上存在有一对顺势羟基。我们利用该结构与二氧化钛间的特异性作用，以各种形式的二氧化钛材料为吸附介质，达到除去生物样品中高丰度正常核苷的目的。这种以二氧化钛材料特异性吸附核苷的概念和方法为本专利首次提出。

发明内容

本发明所要解决的问题在于克服现有技术的不足，提供一种步骤少、效率高的去除样品中正常核苷的前处理方法。

为解决上述问题，本发明利用二氧化钛材料对样品中正常核苷的特异性萃取，达到在检测2’-脱氧核苷及2’-O修饰的核苷前，除去样品中存在的大量正常核苷的目的。

具体方案为：

将DNA或RNA样品溶于水中，通过二氧化钛柱，然后用水淋洗，所得洗脱液中不含核苷；或者将DNA或RNA样品溶于水中，溶解液和二氧化钛混合，涡旋15分钟以上，然后离心分离，所得清液不含核苷。

上述的二氧化钛，粒径为20微米到40微米。

上述的二氧化钛，可以包覆于其他材料的表面，如TiO₂包裹SiO₂材料。

各种形式的二氧化钛材料均可以用于相关处理过程，如纳米颗粒、纤维、薄膜、微球、粉末、涂层等等。吸附形式亦有多种选择，如固相萃取，分散固相萃取等。经过测定，样品中正常核苷浓度在较宽的范围内均可以得到有效去除（如500μg/mL），符合各种实际样品中应用的要求。

附图说明

图1为本发明中涉及到的固相萃取流程示意图。

图2为实施例1中涉及到的LC-UV色谱分析图。（I）为4种正常核苷及4种脱氧核苷混合样品直接进样分析结果；（II）为4种正常核苷及4种脱氧核苷混合样品经过TiO₂固相萃取后分析结果。

图3为实施例2中涉及到的LC-UV色谱分析图。（I）为腺苷及2’-脱氧腺苷混合样品直接进样分析结果；（II）为利用商品化的TiO₂纳米颗粒对样品进行分散固相萃取后的分析结果；（III）为利用液相沉积法制备的TiO₂包裹SiO₂材料对样品进行分散固相萃取后的分析结果；（IV）为利用实施例1中使用的TiO₂粉末对样品进行分散固相萃取后的分析结果。

图4为实施例3中涉及到的正常核苷的LC-MS/MS选择离子流图。（A）腺苷；（B）尿苷；（C）胞苷；（D）鸟苷。（I）为酵母样品直接分析结果；（II）为酵母样品利用传统酶解法处理一次后分析结果；（III）为酵母样品利用传统酶解法处理两次后分析结果；（IV）为利用TiO₂固相萃取后分析结果。

图5为实施例3中涉及到的2’-脱氧核苷的LC-MS/MS选择离子流图。（A）2’-脱氧腺苷；（B）胸苷；（C）2’-脱氧胞苷；（D）2’-脱氧鸟苷。（I）为酵母样品直接分析结果；（II）为酵母样品利用传统酶解法处理一次后分析结果；（III）为酵母样品利用传统酶解法处理两次后分析结果；（IV）为利用TiO₂固相萃取后分析结果。

图6为实施例4中涉及到的正常核苷及2’-O修饰核苷的LC-MS/MS选择离子流图。（A）为宫颈癌细胞样品直接分析结果；（B）为宫颈癌细胞样品利用TiO₂固相萃取后分析结果。

具体实施方式

1.        TiO₂粉末的制备