[发明专利]检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于动物病毒分子生物检测技术领域，具体涉及一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的多重荧光定量RT-PCR方法，及其应用于同时对PRRSV美洲型经典毒株、美洲型变异毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株进行快速检测。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS），又称“猪蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起猪的一种高度接触性传染病，临床上主要表现为妊娠母猪流产、早产、产死胎、木乃伊胎等繁殖障碍以及各种年龄猪特别是仔猪的严重呼吸道疾病。PRRS最早于1987年在美国发生，1991年荷兰首次分离到PRRSV，美国亦于1992年分离到该病毒。此后，该病相继在各主要养猪国家发生，现已呈世界性流行，给世界各国养猪业造成巨大的经济损失。根据病毒基因组的差异，PRRSV可分为欧洲型和美洲型毒株，两种基因型毒株之间基因组差异很大，核苷酸序列同源性仅为60 %左右。1996年郭宝清等首次在国内分离到PRRSV，证实该病在我国存在。2006年国内爆发高致病性猪蓝耳病（HP-PRRS），并证实其病原是以Nsp2蛋白481 aa和533~561 aa发生30个氨基酸不连续缺失为标志的高致病性变异毒株（HP-PRRSV）。2010年我国开始在临床使用HP-PRRSV致弱的活疫苗，以便有效防控HP-PRRS。这些弱毒疫苗毒株包括由JXA1株致弱的JXA1-R株、由HuN4株致弱的HuN4-R株、由TJ株致弱的TJM-F92株等。其中，TJM–F92疫苗株是在HP-PRRS发病猪体内分离的高致病性强毒TJ 株通过噬斑筛选后，在Marc-145细胞上传代至92 代，获得了致弱的疫苗毒TJM–F92株。TJM–F92株Nsp2蛋白除了与其它HP-PRRSV一样在多变区不连续缺失30 aa以外，还出现了第1882~2441 aa共120个氨基酸(360个碱基)的连续缺失。2010年农业部批准临床使用HP-PRRSV致弱的活疫苗以来，广西一直采购、使用TJM–F92株活疫苗，而未采购、使用其他弱毒株活疫苗，以便于正确区分临床发病猪体内的PRRSV野毒株和疫苗株。

当前，国内PRRSV美洲型流行毒株既有经典毒株，也有HP-PRRSV，加上临床使用的弱毒疫苗株，在临床检测中经常发现在同一地区甚至同一养殖场的猪群中同时存在两种或两种以上的病毒株，给该病的诊断带来极大的困难，这就使得建立PRRSV的快速鉴别检测方法显得尤为重要。迄今，国内外建立了一些技术，包括双抗体夹心ELISA、间接免疫荧光抗体试验（IFA）、原位杂交技术（ISH）、反转录聚合酶链反应（RT-PCR）、单重及多重荧光定量RT-PCR等。但是已经建立的技术都无法同时检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及TJM-F92疫苗毒株。因此，建立能同时检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及TJM-F92疫苗株的检测方法不仅能弥补现有技术在这一领域的空白，还具有创新性实践意义。

荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，是指在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对待测模板进行定性、定量分析的方法。由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已被广泛应用于细菌、病毒等病原体检测、肿瘤基因检测、免疫分析、基因表达、基因突变及其多态性的研究等多个领域。多重荧光定量PCR是荧光定量PCR的一种特殊形式，是在同一反应体系中加入多对引物和多条探针，同时扩增、检测多个模板的荧光定量PCR技术。

发明内容

本发明的目的是采用多重TaqMan荧光定量RT-PCR技术，针对PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株基因组中的保守序列，建立同时检测PRRSV的多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，提供同时检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株的引物、探针及其方法。本发明特异性强、灵敏度高，操作安全方便，能实现PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及高致病性PRRS活疫苗TJM-F92株等三种毒株的同时检测，为PRRSV美洲型野毒株、弱毒疫苗株的同时快速鉴别检测及有效防控HP-PRRS提供了新的途径，具有良好的应用前景。