[发明专利]荞麦AFLP反应体系的建立方法及其应用无效
申请号: | 201310422761.1 | 申请日: | 2013-09-16 |
公开(公告)号: | CN103484449A | 公开(公告)日: | 2014-01-01 |
发明(设计)人: | 潘韵;侯雅君;李永新;郑文官;陈义昆;唐明辉 | 申请(专利权)人: | 深圳市圣西马生物技术有限公司 |
主分类号: | C12N15/10 | 分类号: | C12N15/10;C12Q1/68 |
代理公司: | 深圳中一专利商标事务所 44237 | 代理人: | 张全文 |
地址: | 518000 广东省深圳市南山区高*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 荞麦 aflp 反应 体系 建立 方法 及其 应用 | ||
1.一种荞麦的AFLP反应体系的建立方法,包括如下步骤:
将荞麦叶片加入CTAB提取液反应0.5~2小时,抽提,得到模板DNA;
将所述模板DNA与内切酶体系混合,在35~38℃下反应1~9小时,得到酶切后的DNA;其中,所述模板DNA与所述内切酶体系的容量比为1~2:9~8,所述模板DNA的OD260-280值为1.8~2.0;
将所述酶切后的DNA与连接体系混合,在16~22℃下反应3~10小时,得到连接后的DNA;其中,所述酶切后的DNA与所述连接体系的容量比为1~2:4~5;
将所述连接后的DNA与预扩增体系混合,进行第一次PCR反应,得到预扩增的DNA;其中,所述连接后的DNA与所述预扩增体系的容量比为3~5:15~17;
将所述预扩增后的DNA与选择性扩增体系混合,进行第二次PCR反应,得到扩增后的特异性DNA;其中,所述预扩增后的DNA与选择性扩增体系的容量比为3~5:15~17;
其中,所述选择性扩增体系包含浓度为0.2~1.0mmol/L的第一选择性引物和浓度为0.2~1.0mmol/L的第二选择性引物、浓度为0~3.0mmol/L的含Mg2+盐溶液;其中,所述第一选择性引物、第二选择性引物与含Mg2+盐溶液的容量比为4~6:4~6:5~15。
2.根据权利要求1所述的荞麦AFLP反应体系的建立方法,其特征在于,所述第一选择性引物为E+2、E+3中的任一种,所述第二选择性引物为M+2、M+3中的任一种。
3.根据权利要求1~2所述的荞麦AFLP反应体系的建立方法,其特征在于,在所述预扩增后的DNA与所述选择性扩增体系混合之前,还包含稀释所述预扩增后DNA的步骤:将所述预扩增后的DNA稀释0~40倍。
4.根据权利要求1~2所述的荞麦AFLP反应体系的建立方法,其特征在于,所述选择性扩增体系还包含如下的组分:PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、TaqDNA聚合酶、重蒸水;其中,所述PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、第一选择性引物、第二选择性引物、TaqDNA聚合酶、重蒸水的容量比为1~2:0.2~0.4:0.4~0.6:0.4~0.6:0.1~0.2:2.2~5.9。
5.根据权利要求1~2所述的荞麦AFLP反应体系的建立方法,其特征在于,所述CTAB提取液包括如下质量百分比的组分:2~2.5%的十六烷基三甲基溴化铵、100~150mmol/L的Tris-HCl、20~30mmol/L的乙二胺四乙酸、1.4~1.6mol/L的NaCl、0.2~1.0%的β-巯基乙醇、1.0~2.0%的聚乙烯吡咯烷酮。
6.根据权利要求1~2所述的荞麦AFLP反应体系的建立方法,其特征在于,所述内切酶体系包括如下组分第一内切酶、第二内切酶、内切酶缓冲液、牛血清白蛋白、重蒸水;其中,所述第一内切酶、第二内切酶、内切酶缓冲液、牛血清白蛋白、重蒸水的容量比为0.2~0.4:0.3~0.6:2.0~3.0:0.2~0.3:11.7~15.3。
7.根据权利要求1~2所述的荞麦AFLP反应体系的建立方法,其特征在于,所述连接体系包括如下组分:T4连接酶、T4连接酶缓冲液、第一内切酶接头、第二内切酶接头、重蒸水;其中,所述T4连接酶、T4连接酶缓冲液、第一内切酶接头、第二内切酶接头、重蒸水的容量比为0.1~0.2:1~2:0.5~1:0.5~1:3.8~9.4。
8.根据权利要求1~2所述的荞麦AFLP反应体系的建立方法,其特征在于,所述预扩增体系包括如下容量百分比的组分:第一引物、第二引物、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、TaqDNA聚合酶、重蒸水;其中,所述第一引物、第二引物、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、TaqDNA聚合酶、重蒸水的容量比为1.0~1.2:1.0~1.2:2.0~3.0:0.4~0.6:0.2~0.3:8.7~12.4。
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