[发明专利]一种利用混合模式层析介质连续分离纯化抗体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用混合模式层析介质连续吸附技术纯化抗体的方法，具体是一种通过多层析柱串联连续吸附装置分离纯化抗体的方法，属于抗体纯化技术领域。

背景技术

抗体是一类特殊的蛋白质分子，被广泛地用于肿瘤等疾病的诊断与治疗中并随着不断的发展，形成了包括多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体在内的三代抗体。截至2012年底，世界各国已经批准了超过30种用于治疗癌症、感染及免疫缺陷疾病的单抗和基因工程抗体药物；2011年，抗体药物已占据了当年全球药物销售额十强中的四席，销售额超过250亿美元。

抗体产品主要来源于捐献者及各类动物的血浆成分或者动物细胞培养上清液等生物原料中。目前，抗体纯化方法大致分为沉淀法和层析法。沉淀分离技术是早期抗体制品制备的主要手段，作为其主要代表的Cohn低温乙醇沉淀技术当前仍是从血浆等体液中提取抗体的主要工艺。沉淀法虽具有工艺简单、安全性高的优点，但生产条件苛刻、产品的收率和纯度较低、自动化水平低也是沉淀法的固有顽疾。此外，沉淀试剂引发的回收、排放和污染问题也是抗体制备中最值得关注的。与之相比，层析法因具备工艺条件温和、通量大、自动化程度高、易于清洁消毒、满足GMP等现行优势，被广泛应用于抗体的分离纯化。当前用于抗体纯化的主要有凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、反相层析及蛋白A亲和层析，其中蛋白A亲和层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析联用纯化抗体已经成为了单抗制备的“黄金标准”工艺。但是作为上述工艺核心技术的蛋白A亲和层析技术也存在着层析介质成本高昂、洗脱和再生条件严苛、蛋白A配基的酸碱稳定性差且易脱落等缺陷，同时蛋白A层析介质的抗体载量通常不足30mg/g介质并随着蛋白A配基的脱落或酶解而恶化，导致规模化生产过程中介质需求量巨大，推高生产成本。

上述缺陷使得蛋白A层析介质在实际应用中受到限制，由此一些可替代蛋白A层析介质的、以色素衍生物、杂环化合物等小分子化合物为配基的新型层析介质应运而生。美国颇尔（Pall）公司的MEPHyperCel介质就是其中的代表。MEP HyperCel介质是一种在抗体分离中得以采用的、以4-硫醇基-乙基-吡啶（4-Mercapto-Ethyl-Pyridine，MEP）为配基的商品化混合模式层析（mixed-mode chromatography，MMC）介质。所述MEP配基的pKa为4.8；当pH大于4.8时（通常为6～9的范围内），配基通过疏水相互作用与抗体结合；当pH小于4.8时（通常为4.0左右），配基和抗体都带有正电荷，抗体因与MEP配基间的静电排斥而洗脱，从而实现抗体的分离纯化。美国专利US6,498,236B1（UpFront Chromatography A/S公司）公开了另一种固相材料表面偶联含羧基的芳香族化合物的层析介质用于抗体的分离。中国专利CN101185881A公开了一种用于免疫球蛋白类蛋白质分离纯化的色谱介质及其制备方法。所述色谱介质为间隔臂末端偶联含有咪唑基团和苯环的双环化合物分子作为色谱介质配基；制备得到的层析介质对抗体具有选择性，可以实现从血浆、腹水、细胞培养上清液中直接分离纯化抗体。Bak和Thomas将包括MEP HyperCel在内的多种MMC层析介质在抗体分离纯化中的性能与蛋白A层析介质进行了系统地比较（J Chromatogr B,2007,848:116-130）。结果表明，MMC层析介质的抗体载量和产品纯度均明显低于蛋白A层析介质。因此，MMC层析介质取代蛋白A层析介质而商用的道路仍然漫长。

解决上述问题的关键在于，如何在确保产品收率的前提下，提高MMC层析的处理能力和产品纯度。对于一个现有的MMC层析柱而言，层析柱的处理能力与产品的收率和纯度之间通常是相互制约的。层析柱处理能力（上样量）的提升通常是以牺牲产品的收率为代价的。为了提升蛋白A层析柱的处理能力，Mahajan等人提出了一种“半连续”层析分离纯化抗体工艺（J Chromatogr A,2012,1227:154-162）。这一工艺的特征在于，当蛋白A层析柱（I柱）出口处抗体浓度达到原料液浓度的1%后，在该层析柱后串联接入一个新的蛋白A层析柱（II柱），以此类推；当I柱出口处抗体浓度达到料液浓度70%时，依次采用清洗缓冲液和洗脱缓冲液冲洗I柱继而洗脱抗体产品。这种“半连续”层析方法在提高蛋白A层析柱处理能力的同时，产品中宿主蛋白（host cell protein，HCP）残留浓度也随着蛋白A层析介质的抗体载量的升高而增大。同时，上述“半连续”层析方法的复杂操作的自动化控制更加困难。

发明内容