[发明专利]无需PCR仪的侧翼核酸序列快速准确扩增方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种无需PCR仪的侧翼核酸序列快速准确扩增方法及应用。

背景技术

科研人员已经发展了几种无需建立cDNA库或筛选克隆的PCR方法，用于获取与已知序列相连的未知序列。这些PCR方法包括反向PCR（IPCR），连接介导PCR（LM-PCR），随机引物PCR（RP-PCR）等。虽然这些方法有一定的效果并被不断改进，但是仍然受制于繁琐的酶切、适配体连接(adaptor ligation)和纯化步骤。而且，RP-PCR的随机引物经常会因为非特异性退火而产生多余产物。之后的复性控制引物（ACP）技术提高了小片断寡聚核苷酸的特异性，可以克服上诉基因步移法的一些缺点，但该技术仍然依赖PCR仪扩增，三轮PCR反应耗时达4个半小时，并且在设计与复性控制引物相匹配的已知区段引物时，仍然要考虑引物退火。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供一种无需PCR仪的侧翼核酸序列快速准确扩增方法及应用。

本发明首次成功的将重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification）与含有次黄嘌呤的引物设计技术相结合，并实现DNA侧翼序列的高效准确扩增。

本发明选用英国TwistDX公司的重组酶聚合酶，他们具有快速、等温、常温扩增的特点，是一种完全不同于PCR的扩增技术，其中的重组酶配对DNA模板的核酸引物，聚合酶合成新核酸链，可以在15分钟左右完成指数级扩增。

在传统的随机引物PCR过程中存在着如下问题：随机引物过短，则有可能造成多轮PCR产物不一致，随机引物过长，则有可能扩增不到产物。为解决这个问题，我们在随机引物设计过程中引入多聚脱氧次黄嘌呤核苷poly(dI)，这样可以使随机引物长度达到20bp以上，有效减少多轮扩增中由于引物长度过短造成的不稳定性；由于引入poly(dI)并不影响随机引物与模板结合时的随机性，在和模板DNA作用时，引物中的poly(dI)能形成一个气泡状的结构（如图1所示），它能够促进poly(dI)前面由5个碱基组成的序列与模板特异性结合而抑制其后面序列与模板的结合，从而只特异扩增与前端5个碱基结合的模板。

本发明提供用于无需PCR仪的侧翼核酸序列快速准确扩增方法的引物，其为：

RPA-nest1c：tcacagaagtatgccaagcgaggiiiiicggtc（如SEQ ID No.1所示）；

RPA-nest1a：tcacagaagtatgccaagcgaggiiiiiaggtc（如SEQ ID No.2所示）；

RPA-nest1t：tcacagaagtatgccaagcgaggiiiiitggtc（如SEQ ID No.3所示）；

RPA-nest1g：tcacagaagtatgccaagcgaggiiiiigggtc（如SEQ ID No.4所示）；

RPA-nest2：tcacagaagtatgccaagcg（如SEQ ID No.5所示）；

RPA-nest3：cagaagtatgccaagcgagg（如SEQ ID No.6所示）。

本发明提供的一种无需PCR仪的侧翼核酸序列快速准确扩增方法，包括如下步骤：

1）第一轮反应

以DNA模板、重组酶聚合酶、第一轮引物进行第一轮反应；

所述的第一轮引物为RPA-nest1c（如SEQ ID No.1所示）、RPA-nest1a（如SEQ ID No.2所示）、RPA-nest1t（如SEQ ID No.3所示）和RPA-nest1g（如SEQ ID No.4所示）；

2）第二轮反应

以第一轮反应产物为模板，加入重组酶聚合酶、第二轮引物，进行第二轮反应；

所述的第二轮引物为RPA-nest2（如SEQ ID No.5所示）；

3）第三轮反应

以第二轮反应产物为模板，加入重组酶聚合酶、第三轮引物进行第三轮反应；

所述的第三轮引物为RPA-nest3（如SEQ ID No.6所示）。

其中，所述重组酶聚合酶为英国TwistDX公司的重组酶聚合酶，具体是TwistDX重组酶聚合酶冷冻干粉（freeze-dried reaction）。

其中，反应体系具体如下：

第一轮反应体系：