[发明专利]一种合成胸腺法新的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种胸腺法新的固相合成方法。 

背景技术

胸腺法新(Thymosin α1，也称胸腺肽α1)是胸腺素主要生物活性成分，为体内重要免疫调节物质，是氮端乙酰化的28个氨基酸组成的多肽。研究表明，胸腺法新促进骨髓干细胞发育分化为原淋巴细胞及前淋巴细胞；诱导T淋巴细胞分化与成熟，使已成熟的T细胞进一步分化为几个不同的亚群，如杀伤细胞、记忆细胞、效应细胞、辅导T淋巴细胞等，并产生各种可溶性介质；增强淋巴细胞对有丝分裂素的反应，并可增加淋巴组织的蛋白质和核酸的合成；增加r-IFN、a-IFN、IL-2、IL-3和淋巴毒素的生成，增强抗病毒和抗肿瘤的免疫反应；抑制自身免疫反应；恢复抑制性T细胞的功能。目前胸腺法新已被广泛应用于临床，治疗多种疾病，如用于慢性乙型肝炎的治疗；用于丙型肝炎、肝细胞癌、恶性黑色素瘤的治疗；用于治疗感染性疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤等的治疗。 

US4517119采用全液相法合成、纯化胸腺法新。氨基酸氮端采用苄基保护，每次去保护都采用Pd催化加氢进行，操作极其繁杂，未给出总收率。US4504415采用全液相法合成、反相HPLC纯化胸腺法新。以18肽片段（11-28肽段）为起始原料计算总收率为12%。US5856440以MBHA树脂为载体，采用氮端保护为Moz（4-甲氧基苄氧甲酰基）的氨基酸进行胸腺法新固相合成。相比Boc法合成，Moz比Boc更容易脱去。因此Moz法合成多肽过程中，可降低因多次去保护造成肽链从树脂上的流失。从而提高总合成收率。Moz法合成胸腺法新收率35%，比Boc法的25%高。CN101484467采用CTC树脂合成胸腺法新。合成时，在序列11-12处的Ile-Thr采用假脯氨酸二肽形式进行合成。最终合成收率40%。CN102199205采用Wang树脂合成胸腺法新，其采用逐步法合成胸腺法新，其粗肽纯度为69.6%，合成收率为56.6%。若采用PEG衍生后的Wang树脂进行合成，则粗肽纯度为57.2%，合成收率为64.4%。未报道总收率。CN1291031采用生物工程法合成胸腺法新，并与商品胸腺法新进行了活性对比。 

这些现有的合成方法存在的共有技术难点为：（1）液相合成胸腺法新工艺操作复杂，费时费力，不利于工业化生产；（2）现有固相合成法，多通过逐一偶联方式获得胸腺法新肽树脂。由于多个困难点（Leu16、Lys17、Glu18、Lys19等）的存在使粗肽纯度较低，容易包含与胸腺法新保留性质相近的杂质而造成HPLC纯化难度增大，总收率不高。 

发明内容

本发明的目的是提供一种胸腺法新的固相合成方法。本发明需要解决的技术问题是：选择一条合适的工艺路线，解决以下技术问题：（1）液相合成胸腺法新工艺操作复杂，费时费力，不利于工业化生产；（2）现有固相合成法后期纯化难度大，产品纯度低、收率不高。 

本发明的制备方法如图1所示，首先由Fmoc-Asp-OtBu和合适替代度的Rink Amide MBHA 树脂开始合成Fmoc-Asp(Rink Amide MBHA树脂)-OtBu，然后将Fmoc-Asp(Rink Amide MBHA树脂)-OtBu采用逐一偶联的方式合成得到胸腺法新肽树脂，再采用醋酸酐/吡啶进行氮端乙酰化；最后对胸腺法新肽树脂进行裂解，得到粗肽，经RP-HPLC纯化得到高纯度胸腺法新溶液、再经RP-HPLC转盐、冷冻干燥得到胸腺法新成品。 

本发明中一些常用的缩写具有以下含义； 

Ac2O：醋酸酐

Pyridine：吡啶

Boc：叔丁氧羰基

Fmoc ：9-芴甲氧羰基

tBu ：叔丁基

Fmoc-AA-OH ：9-芴甲氧羰基保护的氨基酸

Cl-HOBt ：6-氯-1-羟基苯并三唑

DIC ：N，N′- 二异丙基碳化二亚胺

Asp：天冬氨酸

Glu：谷氨酸

Ala：丙氨酸

Val：缬氨酸

Lys：赖氨酸

Leu：亮氨酸

Thr：苏氨酸

Ser：丝氨酸

Ile：异亮氨酸

DMF ：N，N′- 二甲基甲酰胺

Piperidine ：六氢吡啶

TFA ：三氟醋酸

TIS:三异丙基硅烷

MeOH ：甲醇

DCM：二氯甲烷

Kniser test 检测试剂为：茚三酮

HOAc：乙酸