[发明专利]检测鱼类血浆中肉碱含量的高效液相色谱法

说明书

技术领域

本发明属于肉碱含量检测技术领域，尤其涉及一种检测鱼类血浆中肉碱含量的高效液相色谱法。

背景技术

大量研究表明，L-肉碱使用方便，在饲料中添加Ｌ-肉碱具有提高水产动物生长、抗脂肪肝、提高鱼肉品质、减轻杀虫剂、药物、氨等毒性物质对水产动物的毒害作用等效果，其作为一种新型的饲料添加剂被重视起来，并在医药和食品行业也进行了相关的研究利用。

L-肉碱的价格较高，若使用量过多，经济上不划算，但若使用量过小，则达不到理想效果。因此，需要根据动物的种类、生长阶段，饲粮中粗蛋白质、脂肪水平及赖氨酸与蛋氨酸含量添加期等确定L-肉碱的使用剂量，才能有效保证一定的作用效果而又节约成本。根据大量的研究表明，猪的最适添加量30-500mg/kg饲料，鸡添加量为50-150mg/kg饲料，水产动物建议用量在100-400mg/kg饲料。L-肉碱添加量在实际生产应用中，尚可适当调整。

在研究中，肉碱具有含量较少，微生物发酵法产生量低的特点，因此，其检测要求较高，测定困难。真正意义上进行肉碱测定是从本世纪60年代开始的，由Morquis和Fritz提出酶法测定理论，在此以后在其基础上建立了多种测定方法（如色谱法、生物法、化学比色法、光谱法、质谱法），用以确定食物和组织内肉碱的含量。目前荧光检测器和质谱检测器较为昂贵，大多数实验室尚不具备其实验条件，而高效液相色谱早已普及，若能建立相应有效的方法将十分有益。然而，L-肉碱极性大，只有末端紫外吸收等结构特点，给直接分析带来一定困难。

衍生化是一种利用化学变换，将化合物转化成类似该化学结构的物质，例如当检测物质由于无紫外吸收等原因不容易被检测时，可以将其进行衍生化，如加上生色团等，使其生成可被检测的物质。根据所用的衍生化试剂，柱前衍生化高效液相色谱测定法有两种：(1)柱前紫外衍生高效液相色谱法：对溴苯乙酰基溴(p-BPB)是该法最常选用的衍生化试剂，其在波长260nm处有强的紫外吸收，价格便宜且易于购得，Poorthuis等用该方法检测了患有先天性代谢缺陷病的病人尿液中肉碱含量，但根据进一步的研究发现，衍生化试剂p-BPB与肉碱的衍生反应生成的衍生产物含量很低，而且含有较多杂质，难以达到血样检测的要求。Minkler P等为了加快肉碱与衍生化试剂的反应，在二异丙基乙胺的催化作用下选用对溴苯乙酰基三氟甲磺酸盐作为衍生化试剂，约10min便可与肉碱衍生化完全，但缺点是对溴苯乙酰基三氟甲磺酸盐价格昂贵、难以提纯和购得，而且该法测定回收率多低于80％。2002年，Rosenthal报道了采用四丁基氢氧化铵为催化剂，p-BPB与肉碱可获得高反应产率的衍生化物，该法适用于测定血中游离和总肉毒碱含量，回收率为97％，其在一定程度上改进了p-BPB肉碱衍生法，但样品反应时间比较长，需经振摇、离心、加热等反应步骤，至少需3h以上才能完成一次样品预处理。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种准确快速、灵敏度高、重现性好的检测鱼类血浆中肉碱含量的高效液相色谱法，为水产品中该类化合物的含量分析、食品营养及安全的评定提供可靠的技术手段。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：检测鱼类血浆中肉碱含量的高效液相色谱法，先用对溴苯乙酰基溴衍生化试剂与样品肉碱进行柱前衍生化反应，然后采用正相高效液相色谱分离检测。

上述检测鱼类血浆中肉碱含量的高效液相色谱法，包括以下步骤：取鱼类血浆样品300μl，加1mL蛋白沉淀剂，混均后，加入400mg无水磷酸氢二钠和氧化银的混合物及400mg无水磷酸二氢钾，漩涡振荡仪上漩涡振荡5min，8000r/min离心5min，吸取上清液600μL再加入衍生化试剂50μL混均后，70℃水浴90min；冷却后进样20μL作HPLC分析。

蛋白沉淀剂是体积比9∶1的乙腈和甲醇混合液。

无水磷酸氢二钠和氧化银的混合物中磷酸二氢钠和氧化银质量比为9∶1。

衍生化试剂按以下配制：称取40mg p-BPB于试管中，加入1mL乙腈溶解后，再加入100μL 10%四丁基氢氧化铵混匀即可。

HPLC分析色谱条件为：Kromasil Sil色谱柱，规格250mm×4.6mm，5μm；流动相为乙腈-柠檬酸缓冲液，体积比90∶10，每1000mL流动相中加入0.25mL三乙胺,使用前以0.45μm滤膜减压过滤；流速1.2ml/min；柱温35℃；检测波长260nm；进样量20μl。