[发明专利]一种检测土壤谷氨酸脱氢酶活性的分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及土壤中谷氨酸脱氢酶活性的测定，具体地说是一种检测土壤中谷氨酸脱氢酶活性的分析方法。

背景技术

土壤中的谷氨酸脱氢酶催化酮戊二酸生成谷氨酸盐的反应：

氮是土壤中微生物生长繁殖所需最重要的营养元素，细菌和真菌可利用很多种有机和无机氮化合物。微生物对有机氮和无机氮的利用比例强烈影响氮在土壤中的循环以及微生物和植物对氮的竞争。NH₄⁺是土壤中能够被直接利用的无机氮形态，微生物对无机氮的利用有两种机制，结果都是通过胺化作用将α-酮戊二酸合成谷氨酸盐。其中一种途径由谷氨酸脱氢酶（E.C.1.4.13）进行催化。谷氨酸脱氢酶对NH₄⁺的俘获能力较弱，亲合力较小（较大的Km值），因此只有在NH₄⁺浓度较高时这种酶的有效性才能显现出来，但当土壤中微生物活动需要的C源不足时，此种酶的优势就显现出来，因为这种酶发挥作用不需要ATP。对这种酶活性的测定有助于理解微生物对无机氮不同利用途径的强弱，对探究土壤氮的形为具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检验土壤中谷氨酸脱氢酶活性的分析方法。该方法是首次对土壤谷氨酸脱氢酶活性的测定，通过对不同土壤样品的测定表明，分析结果精确可靠，分析重现性较好。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种检测土壤中谷氨酸脱氢酶活性的分析方法：

1）称取过2-4mm筛的土壤风干样品使用氯仿进行熏蒸；

2）称取熏蒸后的土壤每份1克于n（n≥6）支硼硅酸盐试管中，向试管中加入2.2-2.8ml三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.6）振荡50-70分，将酶提取到此溶液中；

3）提取后样品在13000-16000转/分条件下离心1-3分钟；

4）离心后将每一个试管的上清液加入到2个丙烯酸比色皿中，每个取0.5-0.9ml；

5）向其中一个比色皿中加入0.08-0.12ml NH₄⁺溶液（100mM），0.08-0.12ml酮戊二酸溶液（60mM）和0.08-0.12ml NADPH溶液（1.5mM）；

6）另外一个比色皿作为对照，酮戊二酸用等体积的三羟甲基氨基甲烷缓冲液代替；

7）比色皿盖上盖子，混匀，置于室温条件下，在340nm条件下比色，3小时内比色3次，每小时1次，分别得到吸光度值A1,A2和A3；

8）根据得到的吸光度值和标准曲线的斜率b计算出对应的NADPH浓度，设定浓度为S，S=A*b；

9）计算出NADPH浓度在单位时间内的减少量，设定减少量为S_d，S_d=[(S1-S2)+(S2-S3)]/2；

10）谷氨酸脱氢酶活性用单位时间NADPH浓度的减少量来表示，单位μmol NADPH kg^-1干土h^-1)。

标准曲线的制作：溶解1molNADPH于100ml三羟甲基氨基甲烷中得溶液A，分别吸取1,2,3,4,5ml溶液A用100ml三羟甲基氨基甲烷溶液溶解，得到浓度为10，20，30，40和50μmol/ml的B1～B5溶液，将B1～B5溶液在340nm条件下比色，根据得到的吸光度和样品浓度绘制标准曲线，得到斜率b。

本发明方法的测定原理

在土壤中，谷氨酸脱氢酶在发挥上述作用的同时需要消耗NADPH作为电子受体，在反应过程中被氧化，NADPH可以在340nm条件下通过分光光度计检测。通过测定单位时间内NADPH浓度的变化来表示谷氨酸脱氢酶的活性。

具体实施方式

1.试剂配制：

1)三羟基氨基甲烷缓冲液（pH7.6）：溶解12.12g l^-1三羟基氨基甲烷于水中；

2)60mM酮戊二酸溶液：溶解10.09gα-酮戊二酸于100ml缓冲液中；

3)100mM(NH₄)₂Cl溶液：溶解0.89g氯化铵于1l^-1缓冲液中；

4)1.5mM NADPH溶液：溶解1.25gβ-NADPH l^-1缓冲溶液。