[发明专利]重组淡紫拟青霉菌株PNVT8及其应用

说明书

技术领域

本发明属于农业微生物基因工程技术领域，涉及微生物农药基因工程菌的选育和应用，具体涉及一株表达VHb蛋白的淡紫拟青霉菌株PNVT8及其应用。

技术背景

美国线虫学家的研究表明，全世界每年因植物病原线虫所导致的农作物损失率为12.3%，即植物病原线虫每年可以造成1000亿美元左右的直接经济损失，而我国每年约损失133亿美元，仅仅大豆因线虫的危害就损失1亿美元，对农作物的产量和农户的收益造成了极大的冲击。线虫侵入植物后吸收植物体内的营养而影响其正常的生长发育，同时线虫的分泌物还会刺激寄主植物的细胞和组织，导致植株畸形，使农产品减产和品质下降。此外，有些线虫还能传播真菌、细菌和病毒，导致植物快速死亡或减产。线虫目前已经成为仅次于真菌的第二大植物病虫害。我国较为严重的植物线虫病有花生等多种作物的根结线虫病、大豆胞囊线虫病、小麦粒线虫病、甘薯茎线虫病、水稻干尖线虫病、粟线虫病、松材线虫病、柑橘半穿刺线虫病等。普通的物理方法，如轮番耕作、人工除虫、翻耕晒堡等对线虫的防治效果有限，且耗费大量的人力和物力，在现代农业中并不可取。目前主要是通过喷洒化学农药来进行防治，但是已有研究表明化学农药会残留在作物表面，不仅对环境和土地形成了污染，而且也通过植物叶片、果实等被人体摄入进而直接影响人类的生存与健康。一些天然化合物如牛心朴子叶中的甲醇提取物、水杨酸和茉莉酸的甲醇混合物、苦豆子水提取混合物以及来源于微生物的阿维菌素等均能有效防止线虫的危害，但这些天然化合物的成本也较高。进入二十一世纪后，发展新型、高效的微生物农药制剂是国家的重要课题之一，是国家“世纪议程”的优先项目。为此，发展既环保又高效的杀线虫制剂成为很多科研工作者的目标。淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）已被证明是高效的植物病原线虫的生防真菌，它是线虫卵寄生真菌，也是植物根际土壤习居菌，在杀线虫卵方面具有非常大的应用前景

淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus (Thom.) Samson属半知菌纲、丝孢菌目、丝孢菌科、拟青霉属，该属主要特征是分生孢子梗呈瓶状或近球形（瓶梗），在显微镜下观察可看见其分生孢子梗和分支比其他的青霉菌要分散，在菌丝端或短枝上轮生，其分生孢子梗通过干燥的向基部链形成指头状分支，它的孢子形态从单孢卵圆形到纺锤形，无色。淡紫拟青霉在28℃固体PDA平板上培养时生长形成扁平、淡紫色的类似于纺锤形或椭圆形的特征菌落，在液体培养基上培养会形成乳白色菌球，同时使培养基更加透明澄清。

关于淡紫拟青霉寄生进而致死植物病原线虫的机理目前还不是特别清楚，较为流行的说法是淡紫拟青霉直接侵入线虫卵及其2龄以下的幼虫。其大致过程为，当淡紫拟青霉与线虫卵或幼虫接触后，其菌丝在粘性介质中快速生长，把线虫卵的卵黄层撑大，出现3个厚度不均匀且不连续的薄膜，逐渐使卵细胞几丁质层形成空泡，最终导致卵细胞脂质层的大量消失，后来通过电镜观察到，当淡紫拟青霉侵染线虫时会分泌出几丁质酶和丝氨酸酶，几丁质酶可以水解线虫卵细胞的卵黄层，使其失去完整性，进而使几丁质层出现大空泡，使脂质层暴露、松散的散落在内层，同时丝氨酸酶发生作用，导致卵壳的结构发生较大的变化，使脂质层彻底消失，几丁质层大量水解，最终使不完整的卵黄层和剩余的几丁质层相连，最终导致卵细胞死亡。

具有高效、无毒并有利于在作物根尖定植等优点的淡紫拟青霉目前已经在全国范围内有所推广和应用，但是要淡紫拟青霉菌剂在防治柑橘、番茄、大豆等重要经济作物的植物线虫病中大规模的生产应用，就必须考虑成本问题。众所周知，对于好养型菌株在大规模的发酵生产中，供养充足与否直接制约着其产量的高低及经济效益，而目前的主要措施是通过改良发酵设备等手段来增加发酵过程中的溶解氧含量。然而，由于真菌生长代谢的特点，通过物理方法增加溶解氧依然不能满足快速生长时期真菌对氧的需要。