[发明专利]一种中国对虾DWD抗菌肽分子的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种中国对虾具有双乳清酸性蛋白结构域（DWD）的抗菌肽分子的制备方法，以及这种DWD抗菌肽分子的抑菌活性与蛋白酶抑制剂活性的应用，属于基因工程技术领域。 

背景技术

长期以来，在我国食品和药品行业存在着一个难以解决的问题，那就是食品行业和医药行业广泛使用的保鲜剂、抗菌剂、抗生素带来的严重后果。食品行业目前广泛使用的保鲜剂、抗菌剂多数属于化学药品和试剂，这些化学药品和试剂与食品的包装存在于一个空间，一旦被人体吸收将造成十分不良的后果；医药行业被广泛使用的抗生素，目前已经暴露出了滥用抗生素从而不断刺激病菌浸染和致病能力增强的后果，因此，在食品和药品行业寻找绿色、安全、对人体健康没有影响的生物类抗菌物质，已经是一个科学研究的热点问题了。 

在动物的进化史上，低等的动物不像我们人类具有特别发达的后天获得性免疫系统，它们仅仅具有一个固有的、特定的先天免疫系统，正是因为这个较为低等的先天免疫系统的防御功能，才使得数量众多的、进化地位低等的无脊椎动物进化到今天仍然存在于地球上，这也说明了这个低等的先天免疫系统防御功能的强大之处。通过不断研究，存在于低等无脊椎动物体内先天免疫系统的神秘面纱逐渐被揭开，原来在先天免疫系统中主要存在着细胞免疫和体液免疫两种方式，当病毒、细菌、真菌入侵这类动物机体的时候，这两种免疫途径几乎是同时发挥功能的。其中，值得一提的是先天免疫系统体液免疫途径中的抗菌肽分子是清除入侵细菌和真菌的主要免疫效应分子，而且，抗菌肽分子几乎是体液免疫途径中多种信号传导途径的最后表达出来的那个执行清除功能的效应分子，针对革兰氏阳性细菌、针对革兰氏阴性细菌以及针对真菌入侵的各种信号传导途径，通过免疫刺激信号的逐级传递和放大，最终激活了相关抗菌肽基因的转录与翻译，从而形式抗菌功能。因此，抗菌肽分子表达量的高低，直接关系到病原是否能够被彻底清除。 

在众多抗菌肽分子中，有一类分子比较特别，这类抗菌肽分子的典型特点就是存在着由8个半胱氨酸残基形成的4对二硫键而折叠形成的一个球状实体结构域，这个结构域被称为乳清酸性蛋白结构域，简称WAP结构域，在不同的分子中WAP结构域的数量有所不同，常见的是存在一个和两个WAP结构的抗菌肽分子。这类具有乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽分子在发挥清除细菌作用的过程，主要是通过分子的活性位点针对细菌细胞壁的特殊结构进行破坏，从而引起细菌细胞壁产生“漏洞”将细胞内溶物释放出来，引起细菌自身的死亡，所以，这类抗菌肽的抗菌活性具有广泛的作用范围。所以，这类抗菌肽具有如下的优点：第一，作用范围广。第二，作用条件温和。第三，不会引起细菌的抗药性问题。第四，对人体无危害， 因为它属于蛋白质物质，进入人的肠道之后便可被蛋白酶彻底水解形成氨基酸营养物质。 

中国对虾是我国稀有的水产产品，集中分布在我国东部沿海，也是我国主要的水产经济动物。中国对虾在进化过程中，面临白斑综合症病毒以及各种细菌的侵染能够保持以较大的数量分布在我国东部沿海水域，说明其抗病毒、抗细菌、抗真菌能力特别强大。因此，如果将中国对虾具有双乳清酸性蛋白结构域（DWD）的抗菌肽在体外进行重组表达，获得具有抗菌活性和蛋白酶抑制剂活性的重组分子，它在食品抗菌、医用抗生素替代方面具有较大的应用前景。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种中国对虾具有双乳清酸性蛋白结构域（DWD）抗菌肽的制备方法，同时提供该DWD抗菌肽抑菌活性和蛋白酶抑制剂活性的研究方法。 

技术解决方案： 

本发明的具体方法如下：