[发明专利]一种发酵生产L-丙氨酸的高产菌株及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种发酵生产L-丙氨酸的高产菌株及其制备方法，属于微生物技术领域。 

背景技术

L-丙氨酸是组成蛋白质的氨基酸之一，虽然为人体非必须氨基酸， 但却是人体血液中含量最高的氨基酸，在医药、高分子材料、食品等领域具有广泛的用途。在医药领域：L-丙氨酸作为医药中间体，是生产维生素B6及L-氨基丙醇的主要原料；与糖代谢密切相关，在转氨反应中是主要的氨基供体，具有重要的生理功能，在临床上常添加到输液中；另外，L-丙氨酸还是一种很好的利尿药。在高分子材料领域：近年来发现聚乳酸中添加L-丙氨酸可有效提高聚乳酸的性能。在食品领域：L-丙氨酸具有独特的改善风味的效果，与其他氨基酸配合能加强食品和饮料的风味；添加L-丙氨酸可以明显提高食品和饮料中蛋白质的利用率；还可以改善有机酸的酸味，越来越受到人们的欢迎和重视。 

目前，L-丙氨酸的主要工业化生产方法就是酶法转化，即通过富有L-天冬氨酸-β-脱羧酶活力的微生物细胞催化L-天冬氨酸而得到。酶法转化工艺的特点是酶活力高，设备投资小，提取工艺简单，但其主要原材料L-天冬氨酸价格较贵，造成其生产成本较高。Pascal Hols等报道了利用基因工程手段改造乳酸菌，以葡萄糖、蔗糖或乳糖等为原料发酵生产L-丙氨酸（US 6 627 420 B1），但是基因工程方法构建菌种的过程复杂，技术要求高，而且得到的基因工程菌株很难稳定遗传和保藏。高理所等报道了利用紫外线和激光等复合诱变的方法筛选L-丙氨酸的高产菌株（安徽工程科技学院学报，2008，23（1）:19-24），但是由于紫外线对各种微生物的诱变效应不同，加上微生物吸收射线的剂量大小很难把握，且突变后易发生光修复作用，所以紫外线诱变的效果不佳，正突变率较低，死亡率较高。 

离子注入生物体诱变育种是人工诱变方法的一种新发明，是集化学诱变、物理诱变为一体的综合诱变方法。与传统的诱变源如X射线、γ射线、紫外线以及各种化学诱变剂相比，离子注入不仅有能量沉积，还有动量传递、质量沉积及电荷交换等效应。低能离子束对微生物的诱变是直接作用和间接作用的共同结果，其直接作用主要是注入离子的动量传递于细胞的表面产生的溅射作用和沉积于细胞内部产生的刻蚀损伤，而间接作用主要是注入离子的能量沉积于细胞内部产生的自由基所导致的作用。它能够引起染色体的畸变，导致DNA链碱基的损伤、断裂，从而使遗传物质在基因水平或分子水平上发生改变或缺失，大幅提高变异的频率。 

发明内容

本发明的目的是提供一种发酵生产L-丙氨酸的高产菌株，并利用该菌株来生产L-丙氨酸，使其在生产当中能够达到突变谱广、死亡率低、正突变率高、性状稳定的效果。 

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种高产L-丙氨酸的Lds.0108菌株，该菌株已于2013年8月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国 武汉 武汉大学，保藏号为：CCTCC NO:M 2013361。 

本发明还提供一种高产L-丙氨酸的Lds.0108菌株制备方法， 该方法包括：以乳酸产生菌德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）为出发菌株，活化出发菌→低能离子注入法诱变处理细胞→可逆抑制测定法筛选生产L-丙氨酸的高产菌株。 

具体来说该方法包括： 

1、活化出发菌：将出发菌德氏乳杆菌保加利亚亚种在斜面培养基上42℃培养至对数生长期，用0.85 %的生理盐水制成菌悬液，1mL菌悬液含菌数约为10⁷，镜检菌种健壮且无杂菌后，吸取0.1mL菌悬液均匀涂布于无菌空白培养皿上，无菌风吹干制成菌膜，镜检无细胞重叠后，进行下一步；

2、低能离子注入诱变法诱变处理细胞：真空条件下注入的离子为N离子，剂量为1.5×10¹⁴-5×10¹⁶ ions/cm²，能量为15-20keV，脉冲注入，每次注入5s，间隔时间15-40s，注入后用0.5-1mL无菌生理盐水洗下菌体细胞，采用的是定量诱变，经试验检测成功率在5%；