[发明专利]人α-乳清白蛋白单克隆抗体及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及单克隆抗体的制备与应用，尤其涉及一种人α-乳清白蛋白单克隆抗体及其制备方法与应用。

背景技术

α-乳清白蛋白（α-LA）是分子量小、酸性的、高亲和性的Ca²⁺结合蛋白。它几乎存在于所有的哺乳动物乳汁中。人α-乳清白蛋白的分子量为14.1KD。α-乳清白蛋白是人乳中的重要组成成分，约占总蛋白含量的25-35%，而在牛奶中只占总蛋白含量的2-5%。α-乳清白蛋白可与Ca²⁺、Zn²⁺等多种二价阳离子结合，能促进微量元素的吸收。在乳腺分泌细胞中，α-乳清白蛋白作为调节亚基通过与半乳糖苷转移酶相互作用催化乳糖的合成。最近还发现人α-乳清白蛋白的不同折叠突变体具有杀菌和诱导肿瘤细胞死亡的功能，还能与油酸形成复合物杀死皮肤的乳突淋瘤，具有广阔的应用前景。

由于α-乳清白蛋白具有如此重要的功能，人α-乳清白蛋白可以被开发成婴幼儿食品，保健品，运动饮料以及抗菌、抗肿瘤药物等。据FAO预测，全球每年婴幼儿食品市场为58亿美元，人α-乳清白蛋白已成为这些产品的重要成分，加上其它产品开发，人α-乳清白蛋白的市场前景非常巨大。但是目前市场上供应的α-乳清白蛋白主要是从牛奶中纯化的牛α-乳清白蛋白，不过由于牛α-乳清白蛋白在牛乳中含量低（1.2g/L），纯化工艺复杂，而且成本偏高，生产的α-乳清白蛋白无法满足市场需求。更重要的是，牛α-乳清白蛋白并不具备人α-乳清白蛋白的一些营养价值和重要功能，因此人α-乳清白蛋白具有广阔的开发应用前景。但是由于来源有限，限制了人α-乳清白蛋白作为药用蛋白和保健品的使用，因此人们开始利用转基因动物即动物乳腺生物反应高效表达重组人α-乳清白蛋白。

同时，与转基因相伴而生的生物安全问题引起了公众和管理部门的强烈关注和重视。建立精准、快速的检测技术并科学、系统地进行生物安全评价，可防止转基因动物或产品在研究、生产、销售时发生扩散、污染等安全隐患进行检测和监测技术储备和支撑。这不仅是维护消费者知情权和在国际贸易中维护国家利益的必要手段，也是我国履行国际义务、维护国家形象的重要保障。

乳铁蛋白的检测方法有很多，其中ELISA检测法以其快速、准确、灵敏且一次能处理多个样而倍受关注。目前国内外用于ELISA检测的抗体为多克隆抗体，而以单克隆抗体为基础建立起的免疫学检测试剂盒很少。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种人α-乳清白蛋白单克隆抗体。

为了实现本发明的目的，本发明首先提供一株能分泌产生所述人α-乳清白蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

杂交瘤细胞ZZY hLY7E1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101），保藏日期为2013年4月26日，保藏编号为CGMCC No.7459。

本发明还提供了人α-乳清白蛋白单克隆抗体，其由所述杂交瘤细胞株分泌获得。

本发明还提供了人α-乳清白蛋白单克隆抗体的制备方法，用重组蛋白α-LF免疫雌性BALB/c小鼠，取脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，经ELISA法进行阳性克隆筛选、通过有限稀释法进行亚克隆，获得稳定分泌抗α-LA的5株细胞1C7、5E8、5G9、6E6、7E1。取杂交瘤细胞（效价较高同时细胞状态好）注射至小鼠腹腔，收集腹水，亲和柱纯化得人α-乳清白蛋白单克隆抗体。

经鉴定腹水制备前细胞上清效价检测显示细胞7E1效价最高。7E1细胞亚型为IgG1。7E1细胞能与免疫原α-LA反应，不与筛选原牛乳铁蛋白（bLA）反应。用细胞7E1制备腹水，检测腹水效价为1:81000，腹水纯化检测单克隆抗体效价为1:81000，抗体纯度高于95%。

本发明还提供前述人α-乳清白蛋白单克隆抗体在检测转基因牛奶与奶粉中人α-乳清白蛋白中的应用。

所述人α-乳清白蛋白单克隆抗体可用于检测转基因牛奶中表达量数量级为g/L的人α-乳清白蛋白。Western Blot检测显示抗体7E1只与转基因牛奶及奶粉反应，不与非转基因牛奶及奶粉反应。

本发明还提供前述人α-乳清白蛋白单克隆抗体在制备用于检测转基因牛奶与奶粉中人α-乳清白蛋白试剂盒中的应用。

所述人α-乳清白蛋白的夹心ELISA检测试剂盒还包括以下试剂中的一种或多种：

1）洗涤液；

2）底物显色液；

3）反应终止液；