[发明专利]一种血型抗体的间接Dot-ELISA检测方法与应用

说明书

技术领域

  本发明属于血型鉴定技术领域，具体涉及一种血型抗体的间接Dot-ELISA检测方法与应用。

背景技术

血型鉴定在输血治疗中非常重要，并且每天都在发生在全世界。试剂红细胞包括ABO反定型用的试剂红细胞、各种红细胞谱细胞（Panel cell RBC）及特殊或稀有血型红细胞，用于血型鉴定、红细胞血型抗体研究和检查红细胞抗体等方面，这些红细胞血型抗原十分宝贵，也是难得的必备工作试剂。所有的血型血清学实验室都是必须常规配备的。目前，绝大多数血型血清学实验室使用的试剂红细胞，主要是全血经生理盐水多次洗涤，再添加一定量的红细胞保存液后而制成。目前反定型检测使用试剂红细胞，由于其易溶血、保存期短等原因，试剂质量难以保证，由此导致ＡＢＯ血型反定型检测至今未达到规范化、标准化。

现在技术中所建立的红细胞抗体检测方法有试管法，纸片法，微柱凝胶检测卡法等，常规的这些方法都避免不了用到试剂红细胞。

斑点酶联免疫吸附测定法(Dot-ELISA)是以纤维素膜代替免疫酶固相载体法中常用的聚苯乙烯微量反应板而建立的一种免疫检验方法。Dot-ELISA不仅保留了常规ELISA的优点，而且还弥补了抗原或抗体对载体包被不牢等不足，所以具有敏感性高，特异性强，被检样品用量少，节省材料，不需特殊仪器，结果判定简单易行和便于长期保存等特点。 

Dot-ELISA的基本原理与常规ELISA和免疫酶染色法基本相同，即将抗原或抗体首先吸附在纤维素薄膜(如硝酸纤维素膜，NC)表面，并保持其免疫活性，通过与相应的抗体或抗原和酶标记物的一系列免疫反应，形成酶标记抗原抗体复合物，在底物的参与下，结合物上的酶催化底物使其水解、氧化成另一种带色物质，沉着于抗原抗体复合物吸附的部位，呈现出肉眼可见的颜色斑点。试验的结果可通过颜色斑点的出现与否和色泽深度进行判定。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种血型抗体的间接Dot-ELISA检测方法。

本发明的另一个目的是提供一种血型抗体的间接Dot-ELISA检测方法的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

    一种血型抗体的间接Dot-ELISA检测方法，包括如下步骤：

S1.将硝酸纤维素膜固定于96孔板底部得Dot-ELISA 96孔板；

S2.取1～5μL红细胞膜点在S1所述 96孔板孔内的硝酸纤维素膜上，26～37℃干燥10～30min，用100～250μL 3%的脱脂乳封闭96孔板15～45min；

S3.洗板、拍干后向孔中加入100～200μL待检血清溶液，26～37℃反应30～60min；

S4.洗板、拍干后向孔中加入100～200μL酶标二抗溶液， 37℃反应30～45min；洗板、拍干后向孔中加入80～150μL底物显色溶液，显色5～10min，终止反应，记录结果。

优选地，Dot-ELISA 96孔板的制备方法为：将硝酸纤维素膜用蒸馏水侵泡，制合适大小的圆形膜，干燥后放入96孔板中，用固定环压紧硝酸纤维素膜于96孔板底部，放入干燥箱中干燥1～2h即的；

所述固定环为塑料材料制成，固定环为高度为2～4mm，厚度为0.04～0.08mm的圆柱形环。环外径与所用的96孔板孔的内径配套，固定环两端外径分大小端，大端外径稍大于或等于96孔板内孔径，使固定环能与96孔板孔贴紧，不易滑脱，小端外径稍小于96孔板孔内径，使固定时容易压进96孔板孔内。市场上常用的96孔板孔内径大小为6.8mm，对于这样规格的96孔板，所述固定环的大端外径稍大于或等于6.8mm，小端外径稍小于6.8mm即可。所以固定环两端一定要光滑平整，能紧密压紧硝酸纤维素膜与96孔板底部。固定环要有一定厚度使其能与硝酸纤维素膜有一定的接触面积。

优选地，步骤S2所述红细胞膜的制备方法为：向5～20mL抗凝血中加入10～40mL预冷生理盐水，离心得红细胞，按照与红细胞体积比为30～40∶1的量加入预冷0.01 mol/L，pH7.4 Tric-HCl，4℃放置1～2 h，离心、弃上清，重复3~5 次至无肉眼可见的红细胞为止，沉淀物用PBS溶液溶解即得红细胞膜。