[发明专利]一种血型抗体的间接Dot-ELISA检测方法与应用

权利要求书

1.一种血型抗体的间接Dot-ELISA检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.将硝酸纤维素膜固定于96孔板上；

S2.取1～5μL红细胞膜包被硝酸纤维素膜，26～37℃干燥10～30min，用100～250μL 3%的脱脂乳封闭96孔板15～45min；

S3.洗板、拍干后向孔中加入100～200μL待检血清溶液，26～37℃反应30～60min；

S4.洗板、拍干后向孔中加入100～200μL酶标二抗溶液， 37℃反应30～45min；洗板、拍干后向孔中加入80～150μL底物显色溶液，显色5～10min，终止反应，记录结果。

2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，将硝酸纤维素膜固定于96孔板上的具体步骤为：将硝酸纤维素膜用蒸馏水侵泡，制合适大小的圆形膜，干燥后放入96孔板中，用固定环压紧硝酸纤维素膜于96孔板底部，放入干燥箱中干燥1～2h即的；

所述固定环为高度为2～4mm，厚度为0.04～0.08mm的圆柱形环，环外径与96孔板孔的内径配套，固定环两端外径分大小端，大端外径大于或等于96孔板内孔径，小端外径小于96孔板孔内径。

3.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，步骤S2所述红细胞膜的制备方法为：向5～20mL抗凝血中加入10～40mL预冷生理盐水，离心得红细胞，按照与红细胞体积比为30～40∶1的量加入预冷0.01 mol/L，pH7.4 Tric-HCl，4℃放置1～2 h，离心、弃上清，重复3~5 次至无肉眼可见的红细胞为止，沉淀物用PBS溶液溶解即得红细胞膜。

4.根据权利要求3所述检测方法，其特征在于，所述红细胞膜的制备方法为：向20mL抗凝血中加入20mL预冷生理盐水，3000rpm离心15min，弃上清和白细胞层得红细胞，用预冷生理盐水重复洗涤红细胞3次，按照与红细胞膜体积比为40∶1的量加入预冷0.01 mol/L，pH7.4 Tric-HCl，4℃放置2 h，9 000 r/min，4℃离心20 min，弃上清，重复3~5 次至无肉眼可见的红细胞为止，沉淀物用0.01 mol/L，pH7.4的 PBS溶液溶解即得。

5.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述洗板具体步骤为向板内加入200～250μL 0.01 mol/L pH为7.4的 PBS溶液，振摇洗涤3次，每次5min。

6.权利要求1所述血型抗体的间接Dot-ELISA检测方法的应用，其特征在于，应用于血型鉴定。