[发明专利]利用银耳菌体作为催化剂制备银杏内酯B的方法

权利要求书

1.利用银耳菌体作为催化剂制备银杏内酯B的方法，其特征在于以银耳为出发菌株，通过试管斜面菌种、液体摇瓶菌种、种子罐菌种、离心获得菌体，菌体催化银杏内酯合成含有银杏内酯B的反应液，含有银杏内酯B的反应液经过离心、乙酸乙酯萃取、浓缩、酒精复溶，-20℃结晶、过滤、烘干等提取工艺得到银杏内酯B晶体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的银耳菌体菌种为从云南、山西和西藏的任意一种金耳子实体中分离出的金耳伴生菌菌种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：银耳菌种通过液体摇瓶、种子罐和菌体转化银杏内酯，分离提取得到银杏内酯B。其中所述的液体摇瓶种子培养基组成为(单位为克／升)：葡萄糖5～40，玉米粉5～25，蛋白胨1～20，KH₂PO₄1～6，MgSO₄1～4，加水至适当体积，起始pH值为5.0～8.0，100～140℃灭菌20～60分钟；其中所述的种子罐培养基组成为(单位为克／升)：葡萄糖5～40，玉米粉5～25，蛋白胨1～10，KH₂PO₄1～6，MgSO₄1～4，消泡剂0.1～0.8，加水至适当体积，起始pH值为5.0～8.0，100～140℃灭菌20～60分钟；其中所述转化银杏内酯反应液组成为(单位为克／升)：银杏内酯(包括银杏内酯A、B、C和M)10～50，起始pH值为5.0～8.0；其中所述的摇瓶培养的培养条件是：250mL三角瓶装液量为60～150mL，接种3～4块4×4mm小块菌种，置于温度22～30℃，转速120～160转／分钟，培养时间24～48小时；其中所述种子罐的培养条件是：接种量5～10％(种子液体积／接种后体积)，培养温度22～30℃，搅拌速率90～150转／分钟，通风量1：0.3～1v／v／m，培养时间80～90小时；其中所述的转化工艺条件是：种子液4000～6000转／分钟，离心5～20分钟，收集菌体，菌体与反应液按1：5～50(重量：体积)混匀，在温度22～30℃，搅拌速率90～150转／分钟，通风量1：0.3～1v／v／m，转化6～18小时；按照该转化工艺，其中在进行摇瓶培养之前，首先将银耳菌体的斜面菌种接入新配制的马铃薯葡萄糖培养基中进行传代培养，培养温度22～30℃，培养时间24～248小时。

4.根据权利要求1所述的银杏内酯B的方法，转化液4000～6000转／分钟离心，滤液用盐酸或硫酸调节pH1.0～4.0，连续用0.3～3倍发酵液体积的乙酸乙酯萃取2～4次，合并乙酸乙酯萃取液，真空浓缩至干，残渣用无水乙醇溶解，过滤，滤液至于-20℃结晶24～120小时，过滤，滤渣水洗，80℃干燥得到银杏内酯B纯品。

5.根据权利要求1所述的转化提取工艺所制得的银杏内酯B白色，纯度≥99％，银杏内酯转化率>90％。

6.一种银杏内酯B的生产技术，其特征在于包括如下步骤：

在银杏内酯(包括银杏内酯A、B、C和M)加入蒸馏水和酸，调节pH6.0-7.0，配成20-30克银杏内酯／升的反应液，将银耳菌体和反应液按照重量／体积1：20-30混合，在温度20-30℃，搅拌速率100-150转／分钟，反应10小时以上；

反应之后的反应液按照4000-6000转／分钟离心10-20分钟去除菌体，滤液用盐酸或硫酸调节pH2.0-3.0，连续用乙酸乙酯萃取2-4次，合并乙酸乙酯萃取液，真空浓缩至干，残渣用无水乙醇溶解，过滤，滤液至于-20℃以下结晶70小时以上，过滤，滤渣水洗，干燥得到银杏内酯B。