[发明专利]一种芦笋茎枯病菌原生质体制备与再生方法

权利要求书

1.一种芦笋茎枯病菌原生质体制备与再生方法，其特征在于，具体操作步骤如下： 

(1)、制备芦笋茎枯病菌分生孢子悬液： 

挑取芦笋茎枯病菌Phomopsis asparagi菌丝一环，接种在由50mL燕麦琼脂培养基制成的固体斜面上，在温度25℃、光照12h／d条件下培养10-14d，待出现成熟的芦笋茎枯病菌分生孢子器(可分泌出分生孢子)后，加入30mL无菌蒸馏水洗孢子，得到含有孢子团块的孢子液，用移液器将该孢子液振荡打碎孢子团块，过滤，取滤液进行倍比稀释，显微镜下计数，得到浓度为1×10⁶个／mL的芦笋茎枯病菌分生孢子悬液； 

(2)、制备新鲜菌丝体： 

将制备好的分生孢子悬液接种于液体完全培养基中，25℃条件下150r／min摇床培养72h，漏斗过滤，获得新鲜菌丝体； 

(3)、酶解菌丝细胞壁： 

取1.0g新鲜菌丝体，加入10mL裂解酶、崩溃酶和蜗牛酶的混合酶液，33℃水浴酶解4.5h，采用1.0mol／L MgSO₄(10m mol／L pH6.98的PBS配制，体积比为MgSO₄：PBS=3∶1)做渗透压稳定剂时，原生质体数量达到2.8×10⁷个／mL； 

(4)、原生质体分离： 

过滤酶解溶液，滤去未被酶解的菌丝残片，滤液于温度4℃、转速5000r／min、离心分离5min；弃上清液，用1-2mL浓度1.0mo1／L的山梨醇溶液洗涤2-3次，收集原生质体重悬于1mL浓度1.0mol／L预冷的山梨醇溶液中保存，得到原生质体悬液； 

(5)、原生质体再生： 

将原生质体悬液用浓度0.6mol／L的蔗糖溶液稀释100倍，取稀释液0.1mL涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板和高渗马铃薯葡萄糖琼脂平板；温度25℃、保持相对湿度60％-75％、光照培养12h／d，培养3-5d直至长出直径约1mm再生菌落；调查再生情况，对形成的菌落记数(A)；以 不含稳渗剂的PDA培养基作对照(B)。计算再生率，再生率(％)=(A-B)×100／总原生质体数。 

2.根据权利要求1所述的一种芦笋茎枯病菌原生质体制备与再生方法，其特征在于，所述的步骤(3)混合酶液由下列重量配比的物质组成：裂解酶15g／L、崩溃酶10g／L、蜗牛酶15g／L、溶剂为1.0mol／L MgSO₄(10m mol／L pH6.98的PBS配制，体积比为MgSO₄：PBS=3：1)，配置好后用直径为0.45μm的超微微孔滤膜过滤除菌。 

3.根据权利要求1所述的一种芦笋茎枯病菌原生质体制备与再生方法，其特征在于，所述的步骤(5)中的高渗马铃薯葡萄糖琼脂培养基由下列重量配比的物质组成：马铃薯200g／L，葡萄糖20g／L，琼脂20g／L，蔗糖205g／L。