[发明专利]一种鸭肠炎病毒细菌人工染色体的构建及其应用

说明书

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种鸭肠炎病毒细菌人工染色体的构建及其应用。 

背景技术

鸭病毒性肠炎（Duck Virus Enteritis,DEV）又名鸭瘟（Duck Plague,DP），是由鸭肠炎病毒（Duck Enteritis Virus,DEV）引起的鸭、鹅等雁形目禽类的一种急性、接触性传染病，各年龄的禽类均可发病。鸭病毒性肠炎在很多国家都有该病的报道，在我国也广泛流行。由于其传播迅速，并且发病和死亡率高，能达50-100%，成鸭甚至在90%以上，已经成为危害养鸭业的主要疫病之一。近几年，陆续有关于鸭肠炎病毒基因组的研究报道；2009年，鸭肠炎病毒基因组序列已经公布并登陆在Genbank(Li Y et al.,2009)，为研究DEV的基因和蛋白功能提供了有力的参考数据。其基因组大小约为150kb，编码78个蛋白质，其中有67个蛋白与α-疱疹病毒有同源性，1个蛋白与γ-疱疹病毒同源，5个与禽疱疹病毒同源。将疱疹病毒的整个基因组克隆到BAC质粒中，然后在细菌中重组其他病毒的具有免疫源性的外源基因，从而构建二价疫苗。 

对于疱疹病毒这样的大基因组病毒（大于100kb），体外操作的难度很大，常规的体外酶切和连接的方法不适合。构建重组病毒的经典方法是将带有目的基因的转移载体与病毒基因组共转染哺乳动物细胞，经细胞内同源重组获得重组病毒。由于存在野生型病毒的干扰，一般需要经过多轮空斑纯化才能筛选得到纯的重组病毒（Domi A et al.,2005;Horsburgh B C et al.,1999），这是一项极为繁琐的工作，有时还会遇到重组病毒传代不稳定的问题。为了克服这种方法的局限，研究人员尝试在大肠杆菌中直接对病毒基因组进行修饰。首先尝试的是大肠杆菌Cosmid载体。由于病毒基因很大，而此载体容量有限（约40kb），必须将病毒基因组分成几段，构成一套重叠的载体，经细胞内的多次同源重组组装成完整的病毒基因组，产生重组毒。Cosmid载体在大肠杆菌中不稳定，共转染的效率低，此外，这些载体在细胞内要经过多次同源重组，其精确性很难保证，发生缺失突变的较高，因而对分离到的重组病毒尚需进一步分析鉴定，不是一种很好的方法。 

在基因组学研究工作的需要下，研究人员开发了一系列适用于大片段克隆的载体和宿主系统，如酵母人工染色体载体（YAC）、大肠杆菌的F因子衍生的细菌人工染色体载体（BAC）和以噬菌体复制子为基础的载体（PAC）。BAC载体可以克隆大至300kb的片段，而且可以在大肠杆菌中稳定的复制（McGeoch D J et al.,1994）。近年来，一系列大的双链病毒基因组陆续被BAC化（Adler H et al.,2000;Borst E M et al.,1999;Azab W et al.,2002;Smith B N et al.,2000）。这些BAC化的病毒基因组转染细胞后，在细胞中能产生感染性病毒粒子，这使得利用细菌的遗传工具操作病毒成为可能。但是，由于某些未知原因，位于基因 组中BAC载体部分不太稳定，BAC化的病毒基因组转染细胞后，载体及其两侧病毒基因组序列会发生不同程度的缺失。为了解决这个问题，BAC载体两侧各引入了一个loxP位点，该载体转入表达Cre重组酶的动物细胞中，Cre酶会催化在两个位点之间的重组反应，从而使原核来源的载体骨架部分从病毒基因组上去除，仅留下34bp的loxP的序列，保证了基因组的保真性和完整性，尽可能的避免了原核来源对插入位臵邻近的病毒基因表达的影响，这样利用BAC克隆的细菌遗传工具操作大基因组病毒更趋完善，该方法成功的用于伪狂犬病毒的BAC克隆（Smith G A et al.,2000）。同源重组和位点特异性重组是广泛被用于修饰BAC克隆的方法。RecA同源重组系统是最早为人们熟知的大肠杆菌同源重组系统。然而，由RecA介导的同源重组所需同源区长达1000bp左右，操作的难度大，相对耗时费力，从而使其应用受到很大程度的限制。RecE/RecT同源重组系统可以催化同源反应在20-25bp的同源区间发生，同源重组效率较高（Muyrers J P et al.,2000;Muyrers J P et al.,2000a）。Red-gam系统与RecE/RecT类似，且重组效率更高（Muyrers J P et al.,2000b;Jamsai D et al.,2003）。至此，人们把这两种重组技术结合起来（Red/ET）实现了直接以PCR产物作为供体分子对目的序列的打靶修饰，可以有效地对BAC克隆上的任意基因进行点突变、插入和缺失等修饰。位点特异性重组是由位点特异性重组酶介导特定位点间的发生位点特异性重组。通用的系统有P1噬菌体的Cre-loxP系统（Smith G A et al.,2000），入噬菌体的Int-att系统（Suzuki Y et al.,2005），和酵母的Flp-FRT系统（Cherepanov P P et al.,1995）。位点特异性重组技术靶向性强、重组效率高，也是修饰BAC克隆的有效工具。这整个过程都是在细菌体内进行的，在很大程度上能避免了离体操作对大分子的损伤。2005年，Li M Z et al.开发了一个有效的方法，用于同源重组方法在体内构建重组DNA分子——交配辅助遗传整合克隆(MAGIC)（Li M Z et al.,2005）。