[发明专利]一种PCR步移方法及其所使用的引物和试剂盒有效
申请号: | 201310360122.7 | 申请日: | 2012-07-19 |
公开(公告)号: | CN103397029A | 公开(公告)日: | 2013-11-20 |
发明(设计)人: | 张红发;任婧 | 申请(专利权)人: | 光明乳业股份有限公司 |
主分类号: | C12N15/11 | 分类号: | C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68 |
代理公司: | 上海智信专利代理有限公司 31002 | 代理人: | 朱水平;沈利 |
地址: | 201103 *** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 pcr 方法 及其 使用 引物 试剂盒 | ||
1.一用于PCR步移技术的半随机引物,其特征在于,其序列如SEQ ID NO.5所示。
2.一种用于PCR步移技术的试剂盒,其特征在于,其包括如权利要求1所述的半随机引物。
3.如权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒还包括dNTP、PCR buffer、Mg2+、Taq DNA聚合酶和dd H2O中的任一种或多种。
4.如权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒还包括基因组DNA抽提试剂。
5.一种以如权利要求2~4任一项所述试剂盒进行PCR步移的方法,其特征在于,其包括如下步骤:第一轮PCR,以与待测DNA已知序列相互补的上游引物1和如权利要求1所述的半随机引物对待测DNA模板进行PCR扩增;所述上游引物1的长度为15~30bp。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述第一轮PCR的PCR反应体系包括如下终浓度的各组分:0.2~3μmol/L上游引物1、0.2~3μmol/L半随机引物、0.2mmol/L dNTP、1×PCR buffer、1.5mM的Mg2+、0.02U/μL TaqDNA聚合酶和1~100ng/μL模板;所述第一轮PCR的PCR扩增程序为:①92-95℃,3-6min;②94℃,30s;③50-64℃,30s;④72℃,30-180s,其中,步骤②至④的循环数为30-45。
7.如权利要求5或6所述的方法,其特征在于,所述的待测DNA为真核生物基因组DNA,在第一轮PCR之后还包括第二轮PCR:以与待测DNA已知序列相互补的上游引物2和如权利要求1所述的半随机引物为扩增引物,以第一轮PCR的产物为模板进行PCR扩增;所述上游引物2位于上游引物1的5’→3’方向的内侧。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述第二轮PCR的PCR反应体系包括如下终浓度的各组分:0.2~3μmol/L上游引物2、0.2~3μmol/L半随机引物、0.2mmol/L dNTP、1×PCR buffer、1.5mM的Mg2+、0.02U/μL TaqDNA聚合酶和1~50ng/μL模板;所述第二轮PCR的PCR扩增程序为:①92-95℃,3-6min;②94℃,30s;③50-64℃,30s;④72℃,30-180s,其中,步骤②至④的循环数为30-45。
9.如权利要求7所述的方法,其特征在于,在PCR完成之后,还需要对第一轮PCR或第二轮PCR的产物进行电泳,选择清晰条带割胶纯化后,进行测序。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述的待测DNA模板为原核生物基因组DNA,所述测序用的引物为所述上游引物1或所述半随机引物;或者,所述的待测DNA模板为真核生物基因组DNA,所述测序用的引物为所述上游引物2或所述半随机引物。
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