[发明专利]一种高效重组表达透明质酸酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效重组表达透明质酸酶的方法，具体地是在透明质酸酶基因N端添加一段寡聚核苷酸序列以显著提高透明质酸酶表达产量，属于基因工程技术领域。

背景技术

透明质酸酶(hyaluronidase,HAase)主要专一性水解透明质酸，广泛存在于真核和原核生物中，在动物机体内参与许多重要的生物学过程，例如细胞分裂、细胞间的连接、生殖细胞的活动、DNA的转染、胚胎发育、受伤组织的修复，以及正常细胞和肿瘤细胞增生，是一种重要的生理活性物质。且于1928年被Duran Reynals首次发现并称为“扩散因子”，1940年被Chain和Duthie正式命名为透明质酸酶。根据透明质酸酶作用的底物特异性和催化机制，水蛭透明质酸酶属于透明质酸3-糖基水解酶家族(EC3.2.1.36)，通过水解HA的β-1、3-糖苷键，生产以四糖分子HA且还原端带有葡萄糖醛酸为主的产物。水蛭来源的透明质酸酶对底物的专一性强，与其它来源的透明质酸酶相比，它对硫酸软骨素、4-硫酸软骨素和6-硫酸软骨素不具有活性，并且不具有转糖苷活性，活性不受肝素影响。因此，水蛭透明质酸酶用于临床药用更具医疗价值意义。1941年Hirst首次证实水蛭透明质酸酶强有力的抗菌性。相关研究实验已经证实透明质酸酶对治疗心肌梗塞效果显著。透明质酸酶在抗肿瘤方面也具有重要的作用，恶性组织经透明质酸酶处理后粘多糖含量增加，有利于肿瘤细胞结合更多的抗癌药物。此外，透明质酸酶在临床上作为“药物扩散因子”、治疗血栓、青光眼和其它药用方面具有更大的应用价值。

目前，水蛭来源的透明质酸酶基因尚未有相关报道。当前水蛭来源的透明质酸酶是以活体水蛭组织提取为主获得，且每个水蛭提取所获得透明质酸酶仅约为230U。本发明采用毕赤酵母重组生产透明质酸酶具有无法比拟的优势，突破了水蛭原料来源的限制和提取分离步骤的繁琐等因素的限制，能够推动透明质酸酶在医疗和科研上的广泛应用。

外源蛋白在宿主中的活性表达与产量是构建工程菌最重要的两个指标，本发明在已获得水蛭透明质酸酶在毕赤酵母中活性分泌表达的基础上，通过人为在N端添加一段寡聚核苷酸序列，显著提高了透明质酸酶的表达产量。在N端添加的一段序列，对于mRNA的转录、稳定性和后翻译修饰，以及信号肽的后加工成熟分泌都有重要影响。而这些因素也显著影响着外源蛋白在宿主菌中的正确折叠、后加工修饰和顺利分泌。

鉴于此，本发明中构建的新型重组工程菌显著提高了重组透明质酸酶的产量，该方法将有利于进一步降低工业化生产水蛭透明质酸酶的成本，更有利于水蛭透明质酸酶的医疗药用和科研范围的扩大。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种高效重组表达透明质酸酶的方法，是在透明质酸酶基因N端添加一段寡聚核苷酸序列，构建透明质酸酶产量显著提高的基因工程菌。

所述在透明质酸酶基因N端添加的一段寡聚核苷酸序列，其核苷酸序列如(a)或(b)所示：

（a）如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

（b）与（a）中的序列具有类似功能，添加至透明质酸酶基因N端不引起翻译移码，能活性表达透明质酸酶并提高重组透明质酸酶表达量和/或酶活。

所述透明质酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；在其N端添加SEQ ID NO.1所述序列后所得重组透明质酸酶基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

具体地，是在透明质酸酶基因HaseA3887（SEQ ID NO.2）的N端添加一段核苷酸，构建重组质粒pPIC9K-His-HaseA3887，转化毕赤酵母P.pastoris GS115进行表达。包括以下步骤：基于透明质酸酶基因HaseA3887，合成引物时，在上游引物BYA3887HF引入限制性酶切位点EcoRI和18个核苷酸（6×his-tag序列），下游引物BYA3887R引入NotI酶切位点；构建的重组质粒pPIC9K-His-HaseA3887经SalI线性化后电转入P.pastoris GS115中并确认HaseA3887基因重组P.pastoris GS115成功。

所述上游引物BYA3887HF:5’-CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACATGAAAGAGATCGCGGTGACAATAGAC-3’；下游引物BYA3887R:5’-TCCGCGGCCGCTTATTTTTTGCACGCTTCAACGTTAGC-3’。