[发明专利]一种分离获得羊膜上皮细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说涉及一种分离获得羊膜上皮细胞的方法。

背景技术

羊膜上皮细胞（amniotic epithelial cells,AECs）在受精后第8天由外胚层细胞发育而来，使其可能维持原肠胚形成胚胎干细胞的可塑性。人羊膜上皮细胞不表达HLA-A，B,C或DR抗原，移植后不易引起免疫排斥反应。在一定条件下，羊膜上皮细胞可分化为成熟的神经元细胞，毛囊和皮肤上皮细胞，羊膜上皮细胞理论上可以分化成为各种组织细胞。因此，对羊膜上皮细胞培养方法的探索及对羊膜上皮的生长特性的研究具有重要意义，可为将来的组织工程应用奠定基础。

人羊膜组织由来源于外胚层的羊膜上皮细胞和中胚层的羊膜间质细胞组成。人羊膜上皮细胞源于外胚层羊膜细胞，保持着早期外胚层细胞的多潜能特性。从正常分娩的胎盘羊膜中，新分离的人羊膜上皮细胞具有干细胞某些表面抗原标志。如SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81，SOX-2，FGF-4和Rex-1，部分人羊膜上皮细胞表达c-kit和Thy-1，所以可以用这些抗原的抗体进行ACEs的检测。

目前，AECs已被证实具有肝细胞的某些特性和功能。采用肝细胞生长因子和地塞米松等为诱导剂对人AECs进行原代培养，RT-PCR检测到肝细胞部分相关基因的表达，提示人ACEs具有分化为成熟肝细胞的潜能。

EGF是由53个氨基酸组成的相对分子质量较低的单链多肽，具有多种生物活性，能刺激体内多种类型的组织细胞分裂和增生。在最初分离的hAECs的存活率不是很高，并且贴壁效果也不是很好，而在添加了EGF后就能有利于hAECs的长期培养，同时抑制了其他类型细胞的生长。

羊膜上皮细胞体外培养的关键在于原代培养，原代培养能否成功很大程度取决于能否获得足够数量活力好的上皮细胞。原代培养分为组织块培养和酶消化法培养，组织块培养由于不是每个组织块都能培养成功，且容易混杂有成纤维细胞污染，培养形成单胚层的时间较长，不利于快速大量获取细胞，难以满足组织工程的需要。国外有采用胰蛋白酶分步多次消化，步骤繁琐，而且单纯的用胰蛋白酶很难获得足够的上皮细胞，且胰蛋白酶消化对细胞的损伤大，消化下来的细胞不易贴壁生长。

发明内容

本发明的内容在于克服以上技术不足，提供了一种分离获得羊膜上皮细胞的方法，该方法为：

将羊膜组织加入胶原酶溶液孵育；

然后将羊膜组织加入胰蛋白酶溶液进行消化；

终止消化并过滤；

将滤液离心后获得羊膜上皮细胞。

其中所述的胶原酶为IV胶原酶或II胶原酶；

其中胶原酶溶液是将1g胶原酶溶解在500ml基础平衡盐溶液中得到的；

其中基础平衡盐溶液的制备是用0.4g的KCl、0.06g的KH₂PO₄、0.132g的Na₂HPO₄.12H₂O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO₃、1.0g的D-葡萄糖、0.10g-0.20g的链霉素（优选0.20g）、0.06g-0.12g的青霉素（优选0.12g），用水定容为1L得到的。

其中胰蛋白酶溶液是将0.5g胰蛋白酶和0.04g EDTA溶解在200ml基础平衡盐溶液中而成。

具体的说，本发明的一种分离获得羊膜上皮细胞的方法，包括如下步骤：

从胎盘上分离得到羊膜组织，用基础平衡盐溶液或PBS溶液冲洗后剪碎；

将羊膜组织中加入胶原酶溶液，37℃下孵育1-2小时（优选2小时）；

然后将混合了胶原酶的组织块在200g下离心5分钟，弃掉上清液；

再加入胰蛋白酶溶液，在37℃振荡消化10-20分钟（优选20分钟），用含10%胎牛血清的标准培养基终止消化；

将消化后的组织块经200目滤网过滤；

将滤液在200g下离心5分钟，弃上清，使用含10%胎牛血清的完全培养基重新悬浮均匀细胞，获得羊膜上皮细胞；