[发明专利]一种分离获得羊膜上皮细胞的方法

权利要求书

1.一种分离获得羊膜上皮细胞的方法，其特征在于该方法为：

将羊膜组织加入胶原酶溶液孵育；

然后将羊膜组织加入胰蛋白酶溶液进行消化；

终止消化并过滤；

将滤液离心后获得羊膜上皮细胞。

2.根据权利要求1所述的分离获得羊膜上皮细胞的方法，其特征在于：

其中所述的胶原酶为IV胶原酶或II胶原酶；

其中胶原酶溶液是将1g胶原酶溶解在500ml基础平衡盐溶液中得到的；

其中基础平衡盐溶液的制备是用0.4g的KCl、0.06g的KH₂PO₄、0.132g的Na₂HPO₄.12H₂O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO₃、1.0g的D-葡萄糖、0.10g-0.20g的链霉素、0.06g-0.12g的青霉素，用水定容为1L得到的；

其中胰蛋白酶溶液是将0.5g胰蛋白酶和0.04g EDTA溶解在200ml基础平衡盐溶液中而成。

3.根据权利要求1或2所述的分离获得羊膜上皮细胞的方法，其特征在于包括如下步骤：

从胎盘上分离得到羊膜组织，用基础平衡盐溶液或PBS溶液冲洗后剪碎；

将羊膜组织中加入胶原酶溶液，37℃下孵育1-2小时；

然后将混合了胶原酶的组织块在200g下离心5分钟，弃掉上清液；

再加入胰蛋白酶溶液，在37℃振荡消化10-20分钟，用含10%胎牛血清的标准培养基终止消化；

将消化后的组织块经200目滤网过滤；

将滤液在200g下离心5分钟，弃上清，使用含10%胎牛血清的完全培养基重新悬浮均匀细胞，获得羊膜上皮细胞。

4.根据权利要求3所述的分离获得羊膜上皮细胞的方法，其特征在于：

其中所述的标准培养基，是900ml DMEM培养基中加入丙酮酸钠0.1100g、L-谷氨酰胺0.1461g、β-巯基乙醇3.8574g、100mM非必需氨基酸10ml；所述的100mM非必需氨基酸配方为L-丙氨酸1500mg/L、L-天门冬酰胺890mg/L、L-天冬氨酸1330mg/L、L-谷氨酸1470mg/L、甘氨酸750mg/L、L-脯氨酸1150mg/L和L-丝氨酸1050mg/L；

其中所述的完全培养基，是标准培养基中添加10%胎牛血清和EGF配制而成，添加后的胎牛血清的体积浓度为10%，EGF浓度为10ng/ml。