[发明专利]一种抗体效价的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗体效价的检测方法，特别涉及利用改性固相载体检测抗体效价的方法。

背景技术

抗体效价是疾病诊断、特异性免疫球蛋白制备和疫苗评价等领域的重要指标，对其检测具有非常实际的意义。在众多的抗体效价测定技术中，ELISA法因为操作简单，速度快，应用最为广泛。

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis， RA)是一种累及周围关节为主的慢性多系统性炎症性的自身免疫病，特征性的临床表现为多个周围关节慢性炎症性病变，可造成永久性的关节畸形，致残率高，被称为“不死的癌症”。因此早期诊断、早期治疗，可延缓病情进展，降低致残率，改善预后。

环瓜氨酸肽（cyclic citrullinated peptide，CCP）是一条人工合成的含有21个氨基酸的多肽，其氨基酸序列为HQCHQESTXGRSRGRCGRSGS，其中X代表瓜氨酸，其通过第3和第16位的半胱氨酸巯基氧化而形成环肽。瓜氨酸残基是类风湿关节炎特异的抗中间丝相关蛋白（filaggrin）抗体识别表位的必需组成部分。抗环瓜氨酸肽抗体（anti-cyclic citrullinated peptide antibody，anti-CCP）是环状聚丝蛋白的多肽片段，是以IgG型为主的抗体，对类风湿性关节炎（RA）具有很好的敏感性和特异性，且抗CCP抗体阳性的RA病人骨破坏较抗CCP抗体阴性者严重。2010年由美国风湿病学会（ACR）和欧洲抗风湿联盟（EULAR）一起宣布新的RA分类诊断标准，抗CCP 抗体被正式列入类风湿性关节炎的诊断标准之中。

目前，抗CCP 抗体的检测ELISA 法应用最广泛。其他检测方法多处于初步的摸索研究阶段，由于检测仪器设备、试剂价格等方面的限制，检测方法仍不成熟，影响检测及诊断性能的因素仍需进一步改进。然而，现有的ELISA法的检测时间还是过长，一般需要2个小时才可以获得结果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗体效价的检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种抗体效价的检测方法，包括如下步骤：

1)      将抗原偶联微球上，得到改性微球；

2)      将改性微球与抗体溶液混合反应；

3)      测定反应液的浊度，确定抗体效价。

一种抗CCP抗体效价的检测方法，包括如下步骤：

1)      在CCP多肽上偶联特异性亲和小分子，在微球上偶联特异性亲和小分子的特异性靶标分子；

2)      将修饰后的CCP多肽和微球混合，得到颗粒型CCP多肽抗原；

3)      将颗粒型CCP多肽抗原与抗体溶液混合，反应；

4)      测定反应体系的浊度，确定抗体效价。

作为本发明的进一步改进，CCP多肽上偶联的特异性亲和小分子为生物素，微球上偶联的特异性靶标分子为链霉亲和素。

在CCP多肽偶联生物素包括如下步骤：

1)      将CCP多肽溶解于缓冲液中，酯化生物素用二甲基亚砜溶解，混合；

2)      室温搅拌反应完全，去除未反应的生物素；

3)      收集、纯化得到偶联生物素的CCP多肽。

在微球上偶联链霉亲和素包括如下步骤：

1)      将羧基化胶乳微球与乙磺酸缓冲液混合，加入EDC和NHS活化，洗涤得到活化微球；

2)      将链霉亲和素溶解于PBS缓冲液中，加入活化微球，室温反应，反应完全后洗涤；

3)      用赖氨酸封闭，得到SA修饰微球。

特别的，上述在微球上偶联链霉亲和素的反应中，链霉亲和素溶解于pH6.8～7.8的PBS缓冲液中。

更进一步的，EDC和NHS的摩尔比为1：（1～2）。

本发明的有益效果是：

本发明的方法，利用生物素-链霉亲和素系统将CCP修饰在聚苯乙烯微球表面成功制备颗粒型CCP抗原；采用本方法制备的颗粒型CCP抗原检测血清中抗CCP抗体效价，检测结果线性良好，检测过程20min即可完成，相对于现有ELISA检测方法需耗时2～3h，可以更为快捷的获得检测结果。

本发明CCP多肽的生物素标记方法，反应条件温和，不会破坏CCP多肽的活性，具有很好的反应活性。

附图说明

图1为生物素修饰CCP结构示意图；

图2为验证生物素修饰CCP效果操作流程图；