[发明专利]樟芝高产三萜菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种经紫外诱变原生质体所选育得到的三萜类化合物产量高的樟芝新菌株及其应用。

背景技术

樟芝又叫牛樟芝（Antrodia cinnamomea），是原产于台湾的珍稀药用真菌，具有极大的药用价值，被誉为“抗癌圣药”、“保肝之王”、“解毒之王”，也是目前价格最贵的药用真菌。现代医学研究证实，樟芝的主要活性成分为三萜类化合物。而野生樟芝数量稀少，人工培植的樟芝子实体虽然具有与野生樟芝相似的三萜成分，但子实体生长缓慢，远远不能满足市场需求。目前，采用现代生物技术进行人工发酵是获得樟芝三萜类化合物的最佳途径，人工发酵技术主要分为固体发酵和深层液体发酵。樟芝固体发酵周期较长(90-180天)，固体发酵产物中总三萜含量约5%左右，远低于野生子实体中10%-45%的总三萜含量；樟芝液体发酵周期相对较短(7-14天)，但产物中基本不含三萜类化合物。因此，这两种人工发酵方式都存在发酵周期长、三萜产量低的缺点。菌种是决定发酵水平的内在因素，多种药用真菌通过诱变育种均显著提升了药用活性成分的产量，实现了药用真菌的产业化生产。李刚（2001）、李颖颖等（2011）通过常规诱变育种分别获得了灵芝高产多糖和三萜的优良菌株；张日俊（2004）通过化学和物理组合诱变筛选到了高产蛋白酶的芽孢杆菌；应汉杰等（2007）通过低能粒子束注入孢子的方式获得了高产核酸酶P1的桔青霉菌。类似的研究不胜枚举，可见，通过诱变育种提高食药用真菌的活性物产量不失为一种有效的手段。

截止目前，有关樟芝的诱变育种研究鲜有报道，仅有的文献资料显示，青岛农业大学山东省应用真菌重点实验室的田雪梅等人（2012）通过物理诱变获得了5株樟芝诱变株，其中编号为327的菌株为多糖和蛋白质高产菌株，多糖和蛋白质的产量分别比出发菌株提高238.2%和10.33%。Gg为三萜高产菌株，三萜产量比出发菌株提高57.86%，液体发酵总三萜产量为18mg/L，折合成干燥菌丝体总三萜含量为0.47%，但是事实上这个三萜含量并不算高，离产业化要求尚有很大差距。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种樟芝高产三萜菌株及其应用，旨在解决现有樟芝菌株人工发酵时三萜类化合物产量低的问题。

在本发明方案中，采用的是紫外诱变原生质体的方法。菌种诱变育种包括物理诱变和化学诱变，常见的物理诱变方法有紫外诱变、微波诱变、空间诱变、⁶⁰Co-γ射线辐照诱变、X射线诱变、离子注入诱变等，化学诱变剂主要有烷化剂、碱基类似物、羟胺、吖啶色素等。其中，紫外诱变具有操作简单、诱变效率高、可重复性强、诱变源易于获得等优点，成为很多生物材料诱变育种的常规手段。

樟芝属于大型真菌，它的孢子外壳坚韧，如果直接用孢子作为诱变材料不仅需要高强度诱变处理，且成功概率低，即使诱变成功也难以在人工条件下萌发。而樟芝菌丝体多为链状复合细胞体，单个细胞发生诱变难以筛选出来，因此菌丝体也不宜作为诱变材料。目前比较先进的做法是原生质体间接诱变，即利用生物酶法去除细胞壁制备原生质体，原生质体对外界环境较为敏感、经诱变处理后很容易发生突变，且再生菌落由单细胞发育而来，容易筛选，再生菌株可以保持原有菌种的主要生物学特点，育种周期大大缩短，突变株生物学性状比较稳定，不易退化。

关于出发菌株的选择，诱变育种所采用的出发菌株也十分关键。目前全世界各菌种保藏机构的樟芝菌种有十几种之多，多数从自然界野生樟芝的子实体或牛樟树树洞中分离而来，这些菌株的菌丝体长势较弱、在平板和液体培养基中生长缓慢。本发明采用菌种编号为ATCC200183的樟芝菌种作为出发菌株，该菌株菌丝体相对粗壮，在平板和液体培养基中生长速度相对较快，用它作为出发菌株有利于筛选出理想的樟芝优良菌种。

本发明的目的是获得在液体培养条件下高产三萜类化合物的樟芝高产三萜菌株。在筛选过程中，以樟芝菌丝体长满平板所需的时间和摇瓶发酵菌丝体总三萜产量为考察指标，利用紫外线对樟芝原生质体进行反复诱变，来获得高产三萜类化合物的樟芝新菌株。