[发明专利]双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药和生物化工领域，具体涉及一种瑞舒伐他汀侧链中间体的酶法制备方法。

背景技术

他汀类药物是目前世界上最畅销的药物大类，它对胆固醇合成的关键限速酶3-羟基-3-甲基辅酶A（HMG-CoA）还原酶具有强烈的抑制作用，可抑制胆固醇的合成，是治疗心血管疾病的重要药物，特别是阿托伐他汀和瑞舒伐他汀近些年都进入了全球最畅销药前十名。(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯是合成瑞舒伐他汀的关键手性中间体，可以通过化学法或生物法加以制备。目前国内主要通过化学法生产，化学还原方法的反应条件往往需要低温(如-70 ℃)，及易燃的硼烷类化合物参与，成本高，纯度低，污染尤其严重，对环境的影响非常大。相对于传统化学法，生物法具有反应温和，效率高，三废产生少等优点，因此具有广泛的应用前景。

目前生物法主要是利用生物催化(5S)-6氯-3-羰基-5-羟基己酸叔丁酯制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。例如美国专利US2008/0248539 公开了一种利用来自于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 的酮还原酶及其突变株还原法生产(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法，该方法利用外源添加的葡萄糖脱氢酶和辅酶因子来维持反应的进行，而且在反应中会产生葡萄糖酸，需用碱维持反应的pH，增加了操作程序，影响反应的原子经济性。由于(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯有两个手性位点，目前生物法分两步还原反应制得，如附图1。反应过程由2步生物法和1步化学法组成。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，系统性研究两个生物催化反应的特性，提供一种一锅法催化制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法，先利用化学法合成底物，优化传统反应路线，筛选到合适的生物催化剂，同时进行两步还原反应，即两步反应可用一锅法完成，如此进行生产，反应步骤简单，可以节省生产原料和和动力能源的消耗，有效地节省了成本，在工业化应用具有十分重要的意义。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法，其特征在于：在反应容器中加入配制好的水相缓冲液，然后依次加入一部分底物6-氯-3,5-二羰基己酸叔丁酯、异丙醇、生物催化剂，于温度25℃～40℃下搅拌反应，利用气相色谱方法（GC）检测反应进程，至转化率达到80％～100％，分批加入另一部分底物6-氯-3,5-二羰基己酸叔丁酯，继续进行反应，至反应转化率达到95%～100％时结束反应，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。

进一步地，所述的生物催化剂的形式为含有酮还原酶基因KRED1和KRED2的重组大肠杆菌或重组酮还原酶的粗酶液。

进一步地，所述的生物催化剂的制备方法为：将含有酮还原酶基因KRED1和KRED2的重组大肠杆菌单菌落分别接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30～38℃下，摇床180-220rpm振荡培养4～8小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30～38℃下，摇床180-220rpm振荡培养，培养至OD₆₀₀值达到0.8～1.2时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM，于22～32℃下继续培养16～20小时，4℃下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞；用2～8倍体积的三乙醇胺缓冲液（2mM，pH7.0）悬浮细胞，细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎10-30分钟，4℃下15000g离心30min，上清液即得重组酮还原酶的粗酶液。

进一步地，所述的水相缓冲液为pH 6.0～8.0 的磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲液，浓度为50～300mM。其中更优选磷酸盐缓冲液，pH6.5～7.5。

进一步地，所述的催化体系在使用重组酮还原酶的粗酶液为生物催化剂时，添加NADP作为反应辅因子，添加量为底物量的0.03%-0.3%（w/w）；在使用重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞为生物催化剂时，无需添加辅因子NADP。

进一步地，在反应体系中加入的Ca²⁺、Mg²⁺等二价金属离子，浓度为0.1-20mM，不仅可以增加大肠杆菌细胞的通透性，而且这些离子还是酮还原酶的增强剂。其中更优选Ca²⁺，根据一个具体方面，所述的反应体系中所用的为CaCl₂。