[发明专利]双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法

权利要求书

1.双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法，其特征在于：在反应容器中加入配制好的水相缓冲液，然后依次加入一部分底物6-氯-3,5-二羰基己酸叔丁酯、异丙醇、生物催化剂，于温度25℃～40℃下搅拌反应，利用气相色谱方法（GC）检测反应进程，至转化率达到80％～100％，分批加入另一部分底物6-氯-3,5-二羰基己酸叔丁酯，继续进行反应，至反应转化率达到95%～100％时结束反应，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。

2.根据权利要求1所述的双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法，其特征在于：所述的生物催化剂的形式为含有酮还原酶基因KRED1和KRED2的重组大肠杆菌或重组酮还原酶的粗酶液。

3.根据权利要求2所述的双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法，其特征在于：所述的生物催化剂的制备方法为：将含有酮还原酶基因KRED1和KRED2的重组大肠杆菌单菌落分别接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30～38℃下，摇床180-220rpm振荡培养4～8小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30～38℃下，摇床180-220rpm振荡培养，培养至OD₆₀₀值达到0.8～1.2时，加入诱导剂，于22～32℃下继续培养16～20小时，4℃下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞；用2～8倍体积的三乙醇胺缓冲液（2mM，pH7.0）悬浮细胞，细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎10-30分钟，4℃下15000g离心30min，上清液即得重组酮还原酶的粗酶液。

4.根据权利要求1所述的双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法，其特征在于：所述的水相缓冲液为pH 6.0～8.0 的磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲液，浓度为50～300mM。

5.根据权利要求4所述的双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法，其特征在于：所述的水相缓冲液为pH6.5～7.5的磷酸盐缓冲液。

6.根据权利要求1所述的双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法，其特征在于：所述的催化体系在使用重组酮还原酶的粗酶液为生物催化剂时，添加NADP作为反应辅因子，添加量为底物量的0.03%-0.3%（w/w）；在使用重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞为生物催化剂时，无需添加辅因子NADP。

7.根据权利要求1所述的双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法，其特征在于：在反应体系中加入的Ca²⁺、Mg²⁺等二价金属离子，浓度为0.1-20mM。

8.根据权利要求7所述的双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法，其特征在于：所述的二价金属离子为Ca²⁺。

9.根据权利要求1所述的双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法，其特征在于：所述的催化体系的底物6-氯-3,5-二羰基己酸叔丁酯分1～3批加入，每次加入的浓度200～800mM。

10.根据权利要求1所述的双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法，其特征在于：第一步反应起始时的反应体系中，底物6-氯-3,5-二羰基己酸叔丁酯的浓度为10％～30％(w/v)，异丙醇的浓度为5％～25％(w/v)，所述还原反应体系的温度为30℃；当选用大肠杆菌全细胞做生物催化剂时：重组酮还原酶的大肠杆菌细胞KRED1的用量为底物质量的2.0％～20.0％(w/w)，重组酮还原酶的大肠杆菌细胞KRED2的用量为底物质量的2.0％～20.0％(w/w)；当选用粗酶液做生物催化剂时，重组酮还原酶的粗酶液KRED1的用量为底物质量的8.0％～80.0％(w/w)，重组酮还原酶的粗酶液KRED2的用量为底物质量的8.0％～80.0％(w/w)。