[发明专利]基于Au NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于Au NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建及其在腺苷检测中的应用，属于适配体传感技术领域。

背景技术

适配体是指经指数富集的配体系统进化技术体外筛选合成得到的一小段单链寡核昔酸序列，对目标分子具有高度亲和性和特异性的识别能力。与抗体为识别元件相比，适配体具有配体广泛、易合成、易标记、化学稳定性好等优势，被广泛应用于目标分子的识别与检测。迄今为止，已有各种以核酸适配体为识别元素的比色传感器、荧光传感器、电化学传感器、发光传感器、石英晶体微天平传感器、表面等离子体共振(SPR)传感器的报道。其中，基于SPR检测法的适配体传感器因无需标记、高灵敏及实时监测等优势而具有良好的应用前景。大部分SPR适配体传感器采用夹心检验法、目标引发构像改变或目标引发链替换与竞争相结合等原理实现对生物分子的检测。尽管这些传感器对目标分子的检测具有较高的选择性和灵敏度，但它们大多按1:1的信号:目标物比例输出信号，无法实现低浓度物质特别是小分子和核酸等的高灵敏检测。因此，发展高灵敏的SPR传感技术用于检测低浓度生物分子具有重要意义。

近年来，核酸分子扩增技术被广泛用于提高适配体传感器的检测灵敏度，如，靶诱导替换聚合、滚环放大、聚合酶链反应、基于核酸内切酶的信号放大反应等。这些方法虽然提高了检测灵敏度，但它们往往需要用到蛋白酶，不仅增加了分析成本，还需要精确控制蛋白酶的反应条件，大大限制了应用。发展无酶放大方法用于生物分子的高灵敏检测尤为重要。基于杂交和链替换的无酶放大技术（如杂交链扩增反应、熵驱动催化、目标催化发夹组装），由于模式固有、易于扩展、无需使用蛋白酶等特点，具有广阔的应用前景。然而，迄今尚未见基于无酶放大技术的SPR适配体传感器用于小分子高灵敏检测的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种基于Au NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建及其在腺苷检测中的应用，它具有检测灵敏和选择性好的优点。

本发明是这样来实现的，在包含腺苷适配体、与适配体部分杂交的探针DNA（c-DNA1）、Au NPs标记的发夹结构DNA（Au-H-DNA1）、预组装在SPR金片上的巯基化发夹结构DNA（H-DNA2）的实验体系中，当没有目标分子腺苷存在时，Au-H-DNA1上的H-DNA1保持发夹结构而不能与预组装在金片表面的发夹结构H-DNA2杂交，无法将Au NPs捕获到金片表面。然而，当存在目标分子腺苷时，腺苷与适配体特异性结合促使适配体发生折叠而构象改变，使得c-DNA1从适配体/c-DNA1双链中释放出来与Au-H-DNA1杂交使其开环，开环后的Au-H-DNA1与预组装在金片表面的H-DNA2杂交将Au NPs捕获到金片上，同时替换出c-DNA1，替换出来的c-DNA1则引发下一轮DNA链替换循环。通过如此DNA链替换循环，单个腺苷分子则可引发大量Au-H-DNA1组装在SPR金片上。Au NPs对SPR信号的放大效应，使得SPR测量信号大大增强，对腺苷的检测限低至pM级别。同时，适配体的高特异性，使得传感器具有良好的抗干扰能力。本发明基于Au NPs对SPR信号耦合放大效应和目标物引发DNA链替换循环双重放大策略构建的SPR适配体传感器，为低浓度生物小分子的高灵敏和选择性检测提供了普适性平台，具有良好的应用前景。

为成功构建所述的适配体传感器，本发明采用以下技术方案：

基于Au NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建包括以下步骤：

（1）Au NPs的制备：将50 mL的质量百分比为0.01%的HAuCl₄溶液加入到100 mL圆底烧瓶中，加热至沸腾后，在机械搅拌下迅速加入1 mL的质量百分浓度为5%的柠檬酸三钠溶液，继续搅拌并保持沸腾，溶液颜色由黄色变成深酒红色时停止加热，搅拌下自然冷却至室温，即获得平均粒径为13 nm的稳定且单分散的Au NPs，于4 °C保存备用；

（2）Au NPs-H-DNA1的制备：巯基化H-DNA1用100 μL新配制的1 mM二硫苏糖醇溶液活化过柱后，与1 mL步骤（1）制备的Au NPs溶液混合，在摇床上振荡孵育12 h，将产物分散于磷酸盐（PBS）缓冲溶液中，25 °C放置40 h；在14000 rpm下离心10 min，弃去上清液，离心后的红色油状沉淀用PBS缓冲溶液清洗并离心3次，除去没有与Au NPs反应的H-DNA1；将获得的Au NPs-H-DNA1重悬于PBS缓冲溶液中，4 °C下保存备用；