[发明专利]一种生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组大肠杆菌的培养方法，尤其是一种生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，属于微生物发酵工程领域。

背景技术

现今心脑血管疾病已是人类健康的最大威胁之一，患病人数逐年上升，而且发病年龄也越发年轻化，田文静等在“乳糖诱导瑞替普酶在大肠杆菌中的可溶性表达”（中国生化药物杂志, 2011, 32(5)）一文中指出全世界每年心血管疾病患者多达1300万。在中国，每年需要进行脑梗塞、心肌梗塞等血栓类疾病治疗的人数就上百万，因此研制和生产高效的溶栓药就显得十分必要。赵友春等在“第三代溶血栓药物研究进展”（药学进展, 2004, 28(2): 72-75）中介绍到，目前溶栓药物已发展到第三代，具有快速溶栓，治愈率高，半衰期长，副作用小等优点，在临床上具有较强的竞争性，但价格也比较昂贵。所以，生产出低成本的溶血栓药物具有显著的经济效益和重大的社会意义。另外，赵友春等在“提高溶栓新药瑞替普酶生产得率的中试研究”（化工科技, 2003, 11(1): 15-17）一文中报道，目前多数是对瑞替普酶菌株的构建和复性纯化研究，而鲜有报道实际生产中是如何进行菌株工业化发酵生产。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，从而可以稳定表达瑞替普酶。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：

（1）种子活化：通过三次扩增获得发酵工作种子液：

第一次扩增：将表达瑞替普酶的工程菌株大肠杆菌在 LBA培养基上活化，然后挑取一个单菌落到10ml LBA培养基，在35～37℃，110-140rpm，培养至OD600=0.8-1.0，得到一级种子培养液；

第二次扩增：将一级种子液按5%-10%的接种量接种至100ml LB培养基，在35～37℃，110-140rpm，培养至OD600=0.8-1.0，即得二级种子液；

第三次扩增：将二级种子液以3%-7%的接种量接入1.5L LB培养基，在35～37℃，110-140rpm，培养至OD600=0.8-1.2，即得发酵工作种子液；

（2）发酵前准备：罐体及管道灭菌，配制培养液并添加消泡剂；校正溶氧电极，pH电极，然后在火焰保护下打开发酵罐的接种口，将发酵工作种子液全部接种于发酵罐中；

（3）发酵：控制发酵条件，发酵温度30-37℃，用氨水调节pH值为6.6-6.9，初始溶氧量25-30%，调节转速为150-250rpm，每隔两小时转速提升20-30rpm，当OD600=20-22时，开始用蠕动泵加入补料培养基，进行补料，补料的流加速度为6-7ml/min；

（4）诱导：当OD600=30-32时，开始添加IPTG 10-12ml进行诱导，诱导表达结束后，收集菌液，离心，分离，即得目的菌体。

其中，上述生产瑞替普酶的大肠杆菌培养方法，所述步骤（2）中发酵罐为19L的发酵罐，所述培养液由纯化水、发酵培养基、酵母提取液组成，所述酵母提取液浓度为12%-18%。

所述步骤（3）中发酵时间为22-26小时。

所述步骤（4）中IPTG的浓度为120g/L，用量为10-12ml，诱导时间为4-5小时；离心转速为8000-9000rpm，温度4℃，离心25-40分钟。

上述生产瑞替普酶的大肠杆菌工业培养方法，所述培养基组成为：

LBA培养基：每升H₂O中蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，琼脂10g，氨苄西林钠100mg；

发酵培养基：A液：每升H₂O中含KH₂PO₄ 25-40g、K₂HPO₄ ·2H₂O 57.5-80g、(NH4)₂SO₄17.5-25.8g、FeSO₄·7H₂O 0.008-0.015g；