[发明专利]编码H5N1亚型禽流感同义血凝素(HA)蛋白以及同义神经氨酸酶(NA)蛋白的基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域。具体而言，本发明提供一种同时表达H5N1亚型禽流感同义血凝素蛋白和同义神经氨酸酶蛋白的重组表达载体，包含有效量的上述重组表达载体的DNA疫苗，所述疫苗可以有效预防和/或治疗H5亚型禽流感病毒的感染。 

背景技术

禽流感(Avian influenza virus，AIV)是由A型流感病毒引起的禽类烈性传染病，至今该病已经遍布世界各地，而H5亚型高致病性禽流感(HPAI)又以其高发病率和高死亡率，对养禽业造成重大威胁。到目前为止，已经报道过多起人感染H5N1亚型的禽流感事件，且死亡率可高达60％。H5N1亚型高致病性禽流感作为一种具有严重危害的人畜共患病，具有重要的经济和公共卫生学意义(Mukhtar et al.，2007)。 

疫苗免疫是防控禽流感最有效的手段。目前大量使用的是鸡胚生产的全病毒灭活疫苗。这种疫苗的生产依赖于大量的鸡胚，并且在新毒株出现的时候很难根据疫情的变化做出迅速的反应，且不同毒株之间交叉保护性较差，这使得疫苗株不得不经常更新(Subbarao and Joseph，2007)，个别地区甚至需要同时使用针对不同抗原群的多种疫苗，这无疑又增大了禽流感疫情的防控难度。研制一种能够同时抵御不同抗原群病毒攻击的“通用型”禽流感疫苗成为当前AIV疫苗研究的新热点。 

DNA疫苗与传统疫苗相比，具有十分显著的优势。DNA疫苗能够同时诱导细胞免疫和体液免疫；不受母源抗体的影响，不会影响免疫检测；制备简单，可以任意组成联合疫苗和多价疫苗等(Gurunathan et al.，2000；Jiang et al.，2007；Liu，2010a；Shah et al.，2010)。因此，DNA疫苗被认为是防控流感的理想疫苗。本研究通过分析禽流感病毒血凝素蛋白(HA)和 神经氨酸酶(NA)这两个变异频繁的保护性抗原基因，将不同毒株抗原性蛋白最大使用频率的氨基酸“聚合”到一条氨基酸序列中，以期获得一种能够同时抵御不同分支禽流感病毒攻击的新型疫苗，并探索其最佳的免疫程序，为DNA疫苗的推广应用和我国禽流感的防控提供技术储备。 

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种能够有效预防或治疗多种分支的H5N1亚型禽流感病毒的感染的DNA疫苗。 

在第一方面，本发明人以我国2008年-2011年间流行的百余株H5N1亚型禽流感病毒为基础，分析其HA氨基酸序列和NA氨基酸序列。使用Clustal W1.8.3软件进行多序列比对及分析，将每个位点出现频率最高的氨基酸确定为该位点的氨基酸，获得了一条同义血凝素(HA)氨基酸序列和一条同义神经氨酸酶(NA)氨基酸序列，并分别命名为Cons-CHA5(SEQ ID NO：1)和Cons-CNA5(SEQ ID NO：2)，可以将其相应的编码核苷酸序列按照宿主细胞的密码子偏好性进行密码子优化，然后分别人工合成密码子优化的编码核苷酸序列，按照常规的分子克隆方法，将上述两种编码核苷酸序列克隆到同一表达载体中。 

在优选的实施方案中，可以将上述相应的编码核苷酸序列的密码子优化为鸡体偏嗜的密码子，通过人工合成获得H5亚型AIV同义Cons-CHA基因(SEQ ID NO：4，为优化后的序列)，Cons-CNA5基因(SEQ ID NO：5，为优化后的序列)，按照常规的分子克隆方法，将上述两种编码核苷酸序列克隆到适于在禽类中表达的同一表达载体中，得到能够预防或治疗禽类的禽流感感染的DNA疫苗。所用的表达载体可以为任何一种真核表达载体，例如，但不限于pCAGGS。 

本领域技术人员应该理解，包含本发明第一方面所述的重组表达载体的细胞也在本发明的保护范围之内。 

在第二方面，本发明提供包含有效量的第一方面所述的重组表达载体的DNA疫苗，所述疫苗有效预防和/或治疗下述分支的H5亚型禽流感病毒的感染：clade2.3.2.c，clade2.3.2.b，clade7.2或clade2.3.4a。 

优选地，所述疫苗有效预防和/或治疗下述H5亚型禽流感病毒的感染： 

A/duck/Guangdong/S1322/2010(属于clade2.3.2.c)， 

A/duck/Hubei/S1513/2010(属于clade2.3.2.b)， 

A/chicken/Shandong/A-10/2011(属于clade7.2)或 

A/duck/Fujian/31/2007(属于clade2.3.4a)。