[发明专利]一种人骨髓间充质干细胞体外培养扩增方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，具体涉及一种人骨髓间充质干细胞体外培养扩增方法，可明显提高细胞扩增数量和细胞活性，增强细胞移植修复肌体组织细胞损伤的功效。

背景技术

人骨髓间充质干细胞作为一种新的用途广泛的种子细胞，既具有增殖能力，又具有多向分化的潜能，在特定的诱导条件下可以分化为骨细胞或软骨细胞、神经元样细胞、脂肪细胞、肌细胞、神经细胞等组织细胞。同时可以分泌多种细胞因子，生长因子和促进造血干细胞增殖、成熟的基质分子；是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。也可在体外培养、诱导和分化，在细胞移植、基因治疗、细胞治疗、组织工程等领域具有广泛的应用前景。

尽管近年来对人骨髓间充质干细胞的研究取得了很大进展，但是分离培养方法的局限性仍然制约着更深一步的研究。目前常用的分离方法有贴壁培养法、密度梯度离心法及流式细胞仪筛选法或免疫磁珠法。①贴壁培养法是根据骨髓间充质干细胞贴壁生长，而造血系细胞悬浮生长的特性对二者进行培养分离，同时利用骨髓间充质干细胞较淋巴细胞、单核细胞易脱落的特点，保证骨髓间充质干细胞在短时间内与培养瓶底分开，从而使骨髓间充质干细胞得到进一步纯化，该法获得的细胞不均一。②密度梯度离心法又分为两种：Ficoll分离液法和Percoll分离液法。贴壁培养法和Ficoll分离液法所获得的干细胞生长较快但纯度过低。而Percoll分离液法所获得的干细胞纯度较好，但生长速度较慢而且可能缺失一部分干细胞。③流式细胞仪筛选法或免疫磁珠法：根据细胞大小不同或者根据细胞表面的一些特殊标志来分离细胞，该方法分选的细胞纯度高，但对细胞的损伤较大，分选后的细胞活力较弱。

国内外大量实验证明，通过长期培养后获得的骨髓间充质干细胞具有非常广泛的分化潜能，形成的终末组织包括脑、视网膜、肝、肠、脾、骨髓、血液、皮肤、软骨等。一方面说明了骨髓间充质干细胞具有跨胚层分化的能力，另一方面说明在适当的培养环境下，骨髓间充质干细胞能诱导向多种细胞分化。培养基是构成细胞体外培养环境的重要因素，虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验却不适合。无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。其工作基础是用合适的激素、营养物和促贴壁物质的组合置换培养基中的成分，在某些培养方案中，细胞直接进入无血清培养，可以消除来自血清的不均一性。但无血清培养基是有化学限定性的，在培养过程中它仍有变动，培养起始时可能有些物质缺乏，而后细胞的产物可能积累，从而使培养基的成分改变，随着传代次数的增加而使细胞处于负增殖状态。因此，获得充足、安全的骨髓间充质干细胞是研究和应用的前提条件。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种人骨髓间充质干细胞体外培养扩增方法，本发明能提高人骨髓间充质干细胞的的扩增效率，同时保持生物学效应及多向分化潜能，可及时准确的为医学科研教学及临床应用提供相关需要的骨髓间充质干细胞。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种人骨髓间充质干细胞体外培养扩增方法，包括以下步骤：

步骤1）将DMEM培养基作为基础培养基，并依次调整浓度加入100mg/L-500mg/L的L-谷氨酰胺、15mg/L-150mg/L的维生素C、10mU/L-20mU/L的胰岛素、10U/L-50U/L的红细胞生成素和5μg/L-255μg/L的血管内皮生长因子，然后以氢氧化钠调节PH值，最后加入胎牛血清并过滤除菌，得到新的培养基；

步骤2）收集人骨髓间充质干细胞原代细胞，制成细胞悬液，计细胞数，调整细胞密度后加入培养基，并接种至培养皿中；

步骤3）将培养皿置于37℃、5%的CO2、95%饱和湿度的CO2培养箱中培养；

步骤4）使用倒置相差显微镜观察细胞贴壁及生长状况，在首次传代后24小时首次换液，并在换液后每48小时换液1次；

步骤5）当细胞达80%至90%融合时，使用PBS洗掉非贴壁细胞及杂质，得到贴壁细胞。

进一步的，所述步骤1）中的新的培养基需放入4℃的环境中保存。

进一步的，所述步骤1）中PH值的范围为7.0-7.2。

进一步的，所述步骤2）中原代细胞用胰蛋白酶消化制成细胞悬液。

本发明的有益效果是: