[发明专利]一种采用微流控芯片构建三维神经网络的装置及其制备和使用方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，更具体地涉及在体外构建三维神经网络模型的方法。

背景技术

在具有神经系统的生物体内，各器官、系统的功能和各种生理过程都在神经系统的直接或间接调节控制下，互相联系、相互影响、密切配合成为一个完整统一的有机体，实现和维持正常的生命活动。此外，神经系统还要对体内各种功能不断进行迅速而完善的调整从而使生物体适应体内外环境的变化。因此，神经系统是生物体内起主导作用的重要功能调节系统。在高等动物，尤其是在哺乳动物中，神经系统是一个由成千上万个神经细胞相互连接形成的多级三维网络，对其组织结构和工作原理的研究对于生物学、医学、药学、组织工程学等来说都非常重要。目前存在的体外神经网络的构建方法包括神经细胞的有序图案化和神经突的可控诱导。

微流控技术已发展为研究细胞生物学的有用工具，其可以精确的控制、监控和操纵细胞外微环境，从而实现神经细胞在二维平面上的图案化以及神经突的诱导。

中国发明专利（CN101748061A）公开了一种建立神经细胞之间单细胞水平连接的装置和生长连接方法，在覆有促神经细胞黏附的蛋白质条带的基底上放置具有微凹槽单元的聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章，将神经细胞送入微凹槽单元并黏附在蛋白质条带上，其突起则沿蛋白条带定向生长而不发生分支，从而获得神经细胞单细胞水平的单线连接。

Nature Methods（NATURE METHODS，AUGUST2005，VOL.2NO.8，599）曾报道过利用微流控装置长期培养和局限原代中枢神经细胞。所用的微流控装置由PDMS芯片和玻璃片基底组成，构建了两个细胞培养区域以及连接它们的微槽。将神经细胞种在其中一个区域后，由于微槽的局限性，只有神经轴突会伸展到另一个区域中，这种装置可以用于构建中枢神经轴突损伤和再生模型。这项技术可以在二维的平面可控诱导神经突的连接，但这并不能真实反应体内神经网络的组织和功能。因为真实的神经网络不可能是二维的，而是在三维空间存在的。

目前已有的在体外构建三维神经网络的方法有利用direct-write assembly技术制备的光聚合水凝胶三维支架，神经细胞在这种支架内形成分支网络（Adv.Funct.Mater.2011,21,47–54）。还有使用硅硼玻璃微球自组装的基底支持神经细胞生长的技术（Ehud Y Isacoff，NATURE METHODS，AUGUST2008，VOL.5NO.8，735），可形成三维的毫米级神经网络，为了提高神经细胞在硅硼玻璃微球上的黏附性，在其表面包覆了一层多聚赖氨酸。虽然这样可以在一定程度上模拟体内三维神经网络的构成，但这只是低级别的神经网络，网络结构不可控且细胞类型分布相对杂乱，而体内真实的神经网络是多级别的，且不同级别的网络上具有特定的细胞亚型，由低级别的神经网络按照高度有序的模式相互连接组成，并且具有标志性的轴突树突极化、兴奋性抑制性分化以及突触发生，同时不同级别的网络上都可测得明显的神经活动。

因此，本领域中需要可以在体外构建具有多级结构的、高度有序且相互连通的三维神经网络的装置，其可实现体外神经网络结构与功能的高度统一，最大可能的模拟体内神经网络的真实组织构成。

发明内容

本发明提供一种体外培养三维神经网络的装置及其制备方法，并利用这种装置构建具有良好的结构和功能发育的三维神经网络，可以检测到神经网络中具有标志性的轴突树突极化、兴奋性抑制性分化以及突触发生，而且可在不同级别的网络上都测得明显的神经活动，同时提出了在神经组织工程、脑机接口、药物筛选平台构建上的可能应用。

本发明的技术方案如下：

在本发明的第一方面，提供了一种体外培养三维神经网络的装置，所述装置包括微流控芯片、用于黏附神经细胞的微球和基底，其中所述微流控芯片包括一层或多层PDMS弹性层并具有通孔，所述PDMS弹性层具有供神经细胞突起延伸的微流管道，所述通孔与基底形成用于容纳微球的小室；所述微球优选为均一直径；所述小室优选为圆形、长方形或串珠形；以及所述基底优选为玻璃基底、PDMS基底或聚苯乙烯基底。

在本发明的装置中，所述微球的直径可以为30-140微米，优选为40-100微米，更优选为40-70微米。

在本发明的装置中，所述微球是硅硼玻璃微球和水凝胶微球中的任意一种。

在本发明的装置中，所述通孔横截面的边长或直径为微球直径的100-102倍，优选20-80倍，更优选40-60倍；