[发明专利]一种利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程脊髓的方法

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程脊髓的制备方法，尤其涉及一种皮肤来源的祖细胞制备组织工程脊髓的方法。

背景技术

脊髓损伤修复是临床救治的难点和重点之一，干细胞移植是治疗脊髓损伤较有前景的方法之一，但目前存在的主要问题有：1.干细胞的自体移植具有无免疫原性和使用方便等优点，但神经干细胞和胚胎干细胞等很难实现自体移植，而皮肤来源的干细胞来源丰富，可进行自体移植。皮肤来源的干细胞可在不同微环境的诱导下分化为包括神经元在内的多种类型的细胞，因而其应用于脊髓损伤修复具有良好的前景和实用价值。2.种子细胞不能更多地分化为神经元和少突胶质细胞等修复细胞，导致其修复效果不佳，因而需要寻找合适的手段诱导其更多地向神经元等分化。3.不适当的移植时机导致移植细胞不能有效地发挥其作用。有研究表明，脊髓损伤后细胞移植的较佳移植时机为伤后10天至2周左右，因而如何在这个时间窗内获得足够量的干细胞或经过合适的扩增条件获得足够量的干细胞是提高干细胞移植修复效果的一个需要解决的实际问题。4.组织工程中移植细胞的存活数量要大大少于修复所需细胞数量。因而需要寻找措施增加移植后干细胞的存活数量，或者增加内源性干细胞的动员，以提高干细胞移植的修复修复效果。

针对上述存在的问题，本领域技术人员致力于开发一种皮肤来源的祖细胞(skin-derived precursors，SKPs)的快速增殖和诱导SKPs更多向神经元和少突胶质细胞分化的方法。然后，以上述条件培养的人源性SKPs为种子细胞构建组织工程脊髓，并将其利用到脊髓功能的修复上。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程脊髓的方法。

为实现上述目的，本发明提供了一种利用SKPs制备组织工程脊髓的方法，包括如下步骤：

1)、分离SKPs

将皮肤样品酒精消毒后，胰酶消化，然后将真皮组织剪成细胞片并碎吹打成细胞悬液，过滤后接种于含DMEM培养液的培养瓶中，2h后，将悬浮的细胞离心后转移到SKPs生长培养基中，培养约7天后，可见悬浮克隆样生长的细胞SKPs。

2)、SKPs快速扩增

将分离得到的SKPs原代细胞移入扩增培养基中进行扩增，所述扩增培养基中含有FGF2 40-60ng/ml和PDGF 40-70ng/ml。

3)、制备组织工程脊髓

将组织工程脊髓材料饱和水溶液，滴加到含NT3(Neurotrophin-3)、维甲酸和Neuregulin的生理盐水溶液中，静置，然后吸走培养皿中的液体，将组织工程脊髓材料经过梯度酒精脱水后，真空干燥；

将扩增后的SKPs，以脑源性神经营养素(brain derived neurotrophic factor，BDNF)腺病毒表达载体感染，12h后收集细胞接种到上述的工程脊髓材料材料上，加入培养基培养。

进一步地，所述步骤1)中，所述皮肤样品为，0.5×4cm²的全层皮肤，所述胰酶质量体积浓度为0.25％，所述SKPs生长培养基为40ng/ml FGF2和20ng/mlEGF的DMEM-F12培养基，培养条件为：湿化的培养箱中37℃培养。

进一步地，所述步骤2)中，所述扩增培养基为含有50-100ng/ml FGF2和30-50ng/ml血小板源性生长因子(Platelet-Derived Growth Factor，PDGF)的DMEM-F12培养基，培养条件为：湿化的培养箱中37℃培养。

进一步地，所述步骤3)中，组织工程脊髓材料饱和水溶液和生理盐水的体积比为1∶1，生理盐水中NT3、维甲酸和Neuregulin的浓度分别为10ng/ml、6ng/ml和10ng/ml，静置时间为30-40min。

优选地，所述步骤3)中，细胞接种密度为5×10⁵/ml，培养基组分为40ng/mlFGF2和20ng/ml EGF的DMEM-F12培养基，培养条件为：湿化的培养箱中37℃培养。

相对于单纯的组织材料，本发明的方法中，含有10ng/ml NT3、6ng/ml维甲酸、10ng/ml Neuregulin的组织工程材料可有效地促进细胞增殖，其向神经元和少突胶质细胞分化的比例为4.8％和1.5％左右，远远高于单纯支架材料的1.8％和0.5％。

附图说明

图1是本发明分离得到的SKPs；