[发明专利]一种肿瘤抗原的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫医学领域，具体而言，本发明涉及肿瘤抗原、其制备和应用等。 

背景技术

细胞生物治疗是运用自身免疫系统的新型癌症治疗方法，具有显著疗效的治疗模式。它运用分子生物学技术和细胞工程学技术，用生物制剂对从病人体内采集的细胞在体外进行培养和处理，再回输到病人体内，从而激发、增强机体自身的免疫功能，达到监视并杀灭病变细胞或修复受损细胞的目的。 

目前已经有大量相关文献报道了采用细胞生物治疗来处理患者肿瘤。例如，中国专利01139230.4报道了一种治疗肿瘤的自体免疫细胞及其制备方法，包括制备自体肿瘤组织mRNA；由自体血分离制备单核细胞；加细胞因子诱导扩增抗原递呈细胞；再用肿瘤mRNA转染抗原递呈细胞即得负载肿瘤抗原的抗原递呈细胞，亦即治疗肿瘤的自体免疫细胞。 

又如，中国专利200710139687.7报道了一种自体大肠癌疫苗的制备方法，包括以下步骤，DC体外诱导培养，获得成熟的DC；取自体大肠癌细胞，得到肿瘤抗原备用；用制备好的肿瘤抗原和制备好的DC混合培养24h，以获得自体大肠癌抗原修饰的DC，再将DC和淋巴细胞按照1∶10～1000的数量比例混合培养。 

然而，现有技术制备的肿瘤抗原，使用效率低，无法直接使用，而且经过大量后期处理，容易使得抗原本身降解或者失活，特异性抗原容易丢失。为此，本发明人经过努力摸索，令人意外地发现腺病毒等病毒裂解肿瘤细胞而产生的碎片均匀且具有强免疫原性，非常适合作为肿瘤抗原，因此研究出了新的肿瘤抗原的制备方法，所获得肿瘤抗原可以直接体内使用，疗效稳定而活性高，也可以体外完成DC等细胞的致敏。 

发明内容

本发明的要解决的技术问题在于提供新的肿瘤抗原、其制备和应用，使得治疗(尤其是直接治疗)肿瘤的疗效得以提高。 

具体而言，在本发明的第一方面，本发明提供了一种肿瘤抗原的制备方法，其包括： 

(1)向培养基中接种肿瘤细胞，并进行培养； 

(2)向步骤(1)获得的培养产物中接种细胞裂解性病毒，并进行培养；和， 

(3)取步骤(2)获得的培养上清液，并分离出分子量不小于20kDa(优选不小于25kDa，如30kDa)的物质作为肿瘤抗原。 

本发明的第一方面的方法是体外方法，不涉及对活体动物(包括人)的处理步骤。因此优选本发明的第一方面的方法不包括获取肿瘤细胞的步骤。肿瘤细胞可以来自培养的肿瘤细胞，购买的肿瘤细胞，或者基于知情同意原则而由医生或者患者提供的肿瘤细胞。 

优选在本发明的第一方面的方法中，肿瘤是实体瘤，更优选是肝肿瘤、肺肿瘤、乳腺肿瘤、皮肤肿瘤、子宫颈肿瘤、脑肿瘤、鼻咽肿瘤和/或胃肿瘤，如肝肿瘤和/或乳腺肿瘤。 

优选在本发明的第一方面的方法中，培养的条件是35～38℃和4.5～6％CO₂，优选是37℃和5％CO₂。该培养的条件分别适用于步骤(1)和步骤(2)的培养。这两个步骤的培养的条件可以是不同的，优选是相同的。 

优选在本发明的第一方面的方法中，步骤(1)的培养的时间是培养至贴壁细胞产生，通常，该时间为4～7天，如5天。 

能够侵入(肿瘤)细胞并使得细胞死亡裂解的病毒，都可以作为本发明的细胞裂解性病毒，如腺病毒。为了避免收集的上清液中存在复制产生的活病毒，产生安全性问题，优选在本发明的第一方面的方法中，细胞裂解性病毒是复制缺陷型腺病毒。当前，已经有许多安全的复制缺陷型腺病毒商品化了，可以方便地从市场上购买获得。 

优选在本发明的第一方面的方法中，细胞裂解性病毒的接种量为0.1～10x10 ¹¹/ml，优选为0.8～2x10¹¹/ml，如1.0x10¹¹/ml。 

步骤(2)的培养的时间要使得细胞裂解性病毒全部侵入(肿瘤)细胞并导致细胞裂解，通常需要20小时以上。优选在本发明的第一方面的方法中，步骤(2)的培养的时间为24～72小时，优选为45～55小时，如48小时。 

在第二方面，本发明提供了本发明的第一方面的方法制备的肿瘤抗原。该肿瘤抗原可以直接作为肿瘤疫苗而在临床上预防或治疗患者的肿瘤，也可以如现有技术那样，在体外使得DC细胞或其他免疫细胞的致敏或活化，然后再用于预防或治疗患者的肿瘤。该肿瘤抗原可以应用于来源的患者本人(即，个性化治疗)，也可以应用于患有同类型肿瘤的其他患者。