[发明专利]一种提高发酵法生产硫酸软骨素类似物产量的方法

说明书

技术领域

一种提高发酵法生产硫酸软骨素类似物产量的方法，属于发酵技术领域。

背景技术

硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)，是一种大分子粘多糖，广泛存在于生物体的软骨组织中，具有润滑、保护及再生等生理功能。CS是由葡萄糖醛酸(D-GlcUA)与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)组成的重复二糖亚基以糖苷键交替连接而成的直链大分子聚合物。近年来，硫酸软骨素具有的生物活性作用，在生物制药、医学材料、化妆产品、保健产品等领域的应用备受关注，特别是其在骨关节疾病、抗凝血的生物活性等方面，市场需求日趋旺盛。

目前，CS的商业化生产方法为提取法，即利用化学方法如中性盐法、碱提取、酶处理等工艺方法从动物组织如猪、牛、羊、鲨鱼等软骨中制得。而国内普遍采用的是稀碱和浓碱的提取法。因提取法生产具有原料受限、工艺复杂、纯度较低及污染严重等诸多因素，国内外不断探索寻求可以利用微生物发酵法生产硫酸软骨素的方法。

早在1988年Rodriguez et al.发现病原菌Escherichia.coli O5：K4：H4能合成一种荚膜多糖，其重复单体为由GlcA、GalNAc和果糖的一个β连接末端的五环糖残基构成的二糖。除了果糖残基，其与未硫酸化的软骨素骨架非常相似。但对于E.coli O5：K4：H4自身的代谢特点，合成硫酸软骨素类似物的产量、产率及生产强度较低。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高发酵法生产硫酸软骨素类似物产量的方法。

本发明的技术方案：

(1)采用大肠杆菌Escherichia coli O5：K4：H4作为出发菌株；

(2)发酵培养基(g/L)：甘油50，蛋白胨3，柠檬酸三钠0.5，MgCl₂·6H₂O0.1，KH₂PO₄2，K₂HPO₄·3H₂O9.7，(NH₄)₂SO₄8；

(3)发酵条件：pH6.0，搅拌转速500rpm，通气量1.5vvm。

在实验室条件下，采用恒速补料或分批-补料-分批培养方法提高发酵生产硫酸软骨素类似物产量的方法，通过此种发酵生产工艺，硫酸软骨素类似物产量得到显著提高。其产量提高至2100-2420mg/L。

本发明的有益效果：利用本发明能够有效提高硫酸软骨素类似物的产量。本发明所提供的透明质酸发酵工艺简单，显著提高了发酵过程中产量。

具体实施方式

以下是E.coli O5：K4：H4生产硫酸软骨素的实施例。

对照实施例：本发明所用的菌种为Escherichia coli O5：K4：H5，摇瓶种子在37℃培养8h，后转入发酵罐中，进行发酵24h，发酵条件为：pH6.0，搅拌转速500rpm，通气量1.5vvm。发酵培养基为(g/L)：甘油50；蛋白胨3；柠檬酸三钠0.5，MgCl₂·6H₂O0.1，KH₂PO₄2，K₂HPO₄·3H₂O9.7，(NH₄)₂SO₄8。硫酸软骨素类似物产量为1380mg/L。

实施例1：发酵罐采用恒速补料培养方法，其余条件同对照实施例。发酵进行至9-10h时，以恒速流加高浓度新鲜培养基，使发酵液中的甘油基本维持在20-25g/L。由此方法发酵至30h，硫酸软骨素类似物产量达到2100mg/L。

实施例1：发酵罐采用补料分批培养方法，其余条件同对照实施例。在发酵进行至9-10h，一次性补入高浓度的新鲜培养基，使培养基各成分浓度达到与初始浓度相同。继续分批培养至20-21h，再次步入新鲜培养基，使培养基中各成分浓度再一次达到初始值，两次补加总量与实施例1一致。用此培养方法发酵生产硫酸软骨素类似物，其产量提高到2420mg/L。