[发明专利]一种β-胡萝卜素降解酶的纯化方法

权利要求书

1.一种β-胡萝卜素降解酶的纯化方法，其特征在于，该方法采用蛋白纯化系统和高效液相色谱法对β-胡萝卜素降解酶进行纯化，利用高效液相色谱法对其纯度进行鉴定，并算出该酶纯化每一步的酶活和比活力，具体按下列步骤操作：

1）在改良查氏培养基中培养葡萄球菌，培养条件为：37℃，恒温培养24h；

2）培养结束后，将发酵液于10000r min^-1冷冻离心20min，取上清得粗酶液，冷冻、干燥、浓缩粗酶液至规定的浓度，取浓缩液过0.22μm有机系滤膜，得上样：

3）纯化：

纯化分三步：

第一步是离子交换，上样于蛋白纯化系统，条件：强阴离子柱MONO Q10/100GL，选择合适的缓冲液进行线性洗脱，选择三个波长同时检测，收集具有降解β-胡萝卜素能力的活性成分；

第二步，将上述得到的活性成分进高效液相色谱进行进一步分离，纯化条件：半制备色谱柱C₁₈，选择合适柱温，以及合适流动相进行梯度洗脱，选择相应波长检测，将具有降解β-胡萝卜素能力的活性峰收集，冷冻干燥浓缩；

第三步，上样于蛋白纯化系统，条件：多肽分子筛Superdex peptide10/300column，选择合适的缓冲液洗脱，选择三个波长同时检测，收集目标峰，浓缩，重新上样于多肽分子筛，同样的条件再次纯化收集目标峰，浓缩进HPLC进行检测；

采用分析液相检测纯度的条件：色谱柱C₁₈，选择合适的柱温及其合适的流动相洗脱，选择相应的波长检测；

将底物β-胡萝卜素配制成胡萝卜素储备液，并建立β-胡萝卜素溶液浓度与吸光值的标准曲线，用以计算β-胡萝卜素降解酶的酶活和比活力。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的改良查氏培养基是在查氏培养基加入质量浓度为0.3%的酵母浸粉。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离子交换中的缓冲液为：

A液：20mM醋酸钠-醋酸溶液，pH5.0；

B液：20mM醋酸钠缓冲液中加1mol l^-1氯化钠；

所述线性洗脱为：上样量为2ml；流速1ml/min；洗脱程序为：

0-30min，A液洗脱；

30min-70min，0-50%的B液线性梯度洗脱；

70min-80min，50%B液洗脱；

80min-110min，100%B液洗脱；

上述的检测波长为280nm，254nm和215nm。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的流动相为：

A液：20mM醋酸钠-醋酸溶液，pH5.0；

B液：乙腈；

所述梯度洗脱为：上样量5ml，流速5ml/min；洗脱程序为：

初始流动相：A液：B液的比例为77.5：12.5；

20min时流动相：A液：B液的比例为50：50；

25min时流动相：A液：B液的比例为40：60；

35min时流动相为100%B液；

40min时流动相：A液：B液的比例为77.5：12.5；

柱温30℃，检测波长为280nm，254nm和215nm。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽分子筛Superdexpeptide10/300column的缓冲液为蒸馏水；上样量500μl；流速0.5ml/min；检测波长为280nm，254nm和215nm；检测时间为70min。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析液相的流动相为：

A液：20mM醋酸钠-醋酸溶液，pH5.0，B液：乙腈；上样量20μl；流速1ml/min；检测波长为280nm、254nm和215nm；柱温：30℃；检测时间为10min。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准曲线的建立为：称取5mg的β-胡萝卜素标准品，溶解于10ml的二氯甲烷中，并加入1g的Tween-80，在通风橱中旋转使其二氯甲烷挥发至干，加入50ml蒸馏水即为β-胡萝卜素储备液，于4℃保存；

分别取20μl，40μl，60μl，80μl，100μlβ-胡萝卜素储备液定容至3.25ml，以蒸馏水为空白，调零于460nm波长处测其吸光值，用所得数据作图可得β-胡萝卜素溶液浓度与吸光值的标准曲线。