[发明专利]猪丹毒杆菌的PCR引物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于动物医学的分子生物学和生产领域，具体涉及主要用于鉴别猪丹毒弱毒疫苗株G4T10株和野毒流行株（包括强毒流行株GD1201等非猪丹毒弱毒疫苗株G4T10株的其他猪丹毒毒株）的PCR扩增引物及其应用。

背景技术

猪丹毒（Swine erysipelas,SE）是由猪丹毒杆菌（Erysipelothrix rhusiopathiae, ER）引起的一种急性热性传染病，其主要特征为高热、急性败血症、皮肤疹块（亚急性）、慢性疣状心内膜炎及皮肤坏死与多发性非化脓性关节炎(Wood R.L., Erysipelas, in: Leman, et al. (Eds.), Diseases of swine, Iowa State University Press, Ames, Iowa, 1992,pp. 475–486)。从这些症状的猪体内分离到的猪丹毒杆菌大多为血清1型（1a亚型和1b亚型）和2型（Takashi et al., Protection Effect of NaOH-Extracted Erysipelothrix rhusiopathiae J.Vet.Med.Sci.60(1):9-14.1998)。本病曾经被称为我国“三大传染病” 之一，近年来，随着养猪集约化发展猪丹毒逐渐淡出人们的视野，但该病并没有完全被净化，在全国各地区一直都有零星出现，给养猪户造成了严重的经济损失（龚平阳，王连想，阳志香．广东地区猪场猪丹毒的发病特点及综合防控措施［Ｊ］．畜禽业总，2010（11）：11－12．）。 

猪丹毒杆菌表面膜蛋白(Surface protective antigen A, SpaA)基因全长约为1881bp，编码大小64KD的蛋白。SpaA蛋白是其主要的免疫原性蛋白，并在感染过程中起作用（Takahashi et al., DNA relatedness amongst Erysipelothrixrhusiopathiae strains representing all twenty-three serovars and Erisiperothrix tonsillarum. Int.J.Syst.Bacteriol.42, 469-473.1992，Sou-ichi Makino et al., Surface antigen, SpaA, of Erysipelothrix rhusiopathiae binds to Gram-positive bacterial cell surfaces，FEMS Microbiology Letters 186 (2000) 313-317）。

目前预防该疾病主要采用猪丹毒杆菌弱毒疫苗来进行免疫防控，我国采用的疫苗主要为猪丹毒弱毒疫苗株G4T10株，该疫苗株是由江苏省农业科学院和南京生物药品厂在20世纪70年代联合研制而成，猪丹毒弱毒株G4T10是强毒株经豚鼠370代和在含有0.01%~0.04%吖啶黄血液琼脂培养基上传10代获得的。

目前，由于生产上常用猪丹毒弱毒疫苗株G4T10株进行对猪丹毒的免疫防控，为了监测疫苗的防疫情况和猪丹毒病情的诊断，迫切需要一种对疫苗弱毒株和野毒流行株感染的鉴别诊断方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的上述问题，通过猪丹毒弱毒疫苗G4T10株的SpaA基因序列（Genbank登录号：KF150604）和强毒株Fujishawa、GD1201株（Genbank登录号：KF177344）等毒株序列对比发现疫苗弱毒株在1369-1488位置缺失119bp，针对序列此特征设计引物建立疫苗弱毒株G4T10株和野毒株鉴别诊断的PCR扩增方法。

本发明提供的猪丹毒杆菌的PCR引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示。

本发明还提供了上述猪丹毒杆菌的PCR引物在制备猪丹毒杆菌的检测试剂中的应用。

优选地，上述猪丹毒杆菌的PCR引物在制备猪丹毒杆菌的检测试剂中的应用，所述猪丹毒杆菌为猪丹毒弱毒疫苗株G4T10株和/或猪丹毒野毒流行株。

本发明还提供了一种猪丹毒杆菌的检测试剂盒，包括如下组分：SEQ ID NO:1~2所示的引物序列，DNA聚合酶，PCR缓冲液，dNTP混合物和无菌双蒸水。