[发明专利]一种提高橡胶草花青素含量的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体地说，涉及一种提高橡胶草花青素含量的方法。

背景技术

橡胶草又名俄罗斯蒲公英(Taraxacum kok-saghyz Rodin)，为菊科菊苣族蒲公英属植物，原产于哈萨克斯坦、欧洲及我国新疆等地（中国植物志）。橡胶草能够生长在盐碱化草甸、河漫滩边，具有广泛的适应性。其根含有6%～28%的天然橡胶，橡胶相对分子量较巴西橡胶更大，但结构和性能相似（安峰等，2012）。随着石油价格的不断上涨，天然橡胶的价格也是急剧攀升，天然橡胶资源紧缺。在此背景下，欧盟和北美相继启动“珍珠计划”（EU-PEARLS）和“天然橡胶替代品卓越合作计划”(PENRA)项目，发展蒲公英橡胶作为第二天然橡胶资源，以应对巴西橡胶资源短缺（焉妮，2011）。

与巴西橡胶树比较，橡胶草中的橡胶分离提取繁琐，生产成本较高，且橡胶草地上部分含胶量低，通常被舍弃，造成极大浪费，这些都阻碍了橡胶草的大规模开发利用。为达到盈利目的，国内外都在寻求橡胶草的综合开发利用。目前比较成功的是生产加工橡胶的同时，获取发酵乙醇、菊糖（可促进人体内双歧杆菌和乳酸杆菌的增殖而抑制病原菌如大肠杆菌、梭状芽胞杆菌和沙门氏菌的生长）等副产品。美国德尔塔公司已建立半自动化的萃取加工厂，用橡胶草生产橡胶并同时获取清洁能源乙醇。在欧洲，利用橡胶草提取橡胶的同时，也将菊糖提取出来作为天然的食品配料（焉妮，2011）。总之，最大限度地增加橡胶草附加值成为橡胶草综合开发利用的新思路。

花青素是一种功能性天然色素。2004年召开的第三届花青素国际学术讨论会上确认花青素具有抗氧化、减少肝伤害、抗诱变性、降血压、改善视力、抗菌、抑制癌细胞的繁殖等多种生理功能，对于有效预防癌症、糖尿病、心血管病等疾病有着重要作用（Yamakawa等,2002Konczak等，2004；王关林等,2005）。此外，酰基化的花青苷具有较高的稳定性，可取代“苏丹红”等存在安全隐患的工业合成色素，用于生产饮料、酒、糖果等食品以及保健品和化妆品等高附加值产品。因此，创建高花青素转基因橡胶草，在提取根中橡胶的同时，提取橡胶草地上部分的花青素，以用于生产保健食品，不仅能够减少工业污染，还能增加橡胶草附加值，将有利于橡胶草的产业化发展。

发明内容

本发明的目的是通过创建高花青素转基因橡胶草，提高橡胶草花青素含量。

为了实现本发明的目的，本发明的一种提高橡胶草花青素含量的方法，采用基因克隆方法获得拟南芥花青素合成调控因子1基因全长，将拟南芥花青素合成调控因子1基因与植物表达载体构建重组表达载体，重组表达载体阳性质粒导入到根癌农杆菌中，采用根癌农杆菌介导转化橡胶草，获得高花青素转基因橡胶草，并对所得的转基因橡胶草进行花青素含量和含胶量测定。本发明的方法包括如下步骤：

1.拟南芥的克隆

1)拟南芥DNA的提取：取拟南芥叶片于离心管中，离心管用液氮速冻，研磨棒将材料迅速碾碎，加入600μl预热的CTAB提取液65℃保温30min，期间不时颠倒混匀；加入500μl氯仿充分混匀，室温，12000rpm，5min,离心分相；将上清转到新离心管中，加入0.7体积的预冷异丙醇，混匀，室温下放置15min沉淀DNA；室温，12000rpm，离心5min，去上清，70%乙醇洗涤沉淀；室温，12000rpm，离心3min，移去乙醇，获得拟南芥DNA，空气中干燥10min，溶于适量无菌水。

2)拟南芥花青色素合成调控因子1基因的聚合酶链式反应扩增：设计可扩增出拟南芥花青色素合成调控因子1基因全长的引物，并在上游和下游引物分别引入XbaI和SacI限制性酶切位点，上游引物为5'-ACTCTAGAATGGAGGGTTCGTCCAAAGG-3'，下游引物为5'-CCGAGCTCCTAATCAAATTTCACAGTCTC-3'（下划线标示为Xba I和Sac I限制性酶切位点）。以拟南芥DNA为模板，经聚合酶链式反应（PCR）扩增，将获得的扩增产物于1%的琼脂糖凝胶电泳进行分离，目标片段回收后与Vector载体连接，转入大肠杆菌DH5α，测序验证并得到所述基因序列。

2.重组表达载体的构建