[发明专利]由高压冷冻材料制作电子显微镜样品

说明书

技术领域

本发明涉及由带有高压冷冻样品材料的毛细管制作样品的方法，该方法包括：

●提供具有玻璃化的(vitrified)样品材料的高压毛细管的步骤，该样品材料处于低于玻璃化转变温度T_g的温度T₁，和

●切割该毛细管的步骤。

背景技术

从Leica微系统(Leica Microsystems)的“Leica EM PACT application brochure(应用手册)”上可以得知这样一种方法，该手册从互联网上可得到，又称为Leica手册[-1-]。

当在TEM(透射电子显微镜)下观察样品时，样品被能量通常在60keV到300keV范围的电子束照射，尽管已知可以使用更低或更高的能量。通过观察透射过样品的电子得到图像。因此样品必须是薄的样品，典型厚度小于1μm，更特别地小于200nm，最特别地小于100nm。当观察生物样品时样品典型地切成薄切片。为了此目的样品首先要固化。这通过例如用塑胶(plastic)替代所有的水来实现，即所谓的树脂包埋，但是采用低温成像取得了更好的结果。

低温成像包括将样品材料冷冻到不形成冰晶体(因为这些会破坏样品)的冷冻温度(cryogenic temperature)，在该冷冻温度下将样品切片，并在该冷冻温度下观察样品。

能够在冷冻温度下观察样品的透射电子显微镜是市售的。

同样冷冻样品的设备也是市售的。这些设备的一部分采用高压冷冻原理，其中样品，容纳在容器(holder)中，首先加压到大约2100巴的压力，然后快速冷却到大约165K的温度T_g，水的玻璃化转变温度。随后将该容器减压，然后可以释放该容器内的样品材料。

在一组这类设备中使用毛细管，例如铜毛细管。采用这些毛细管的这类样品制备设备和方法的实例描述在Leica手册[-1-]中，具体见第7和8页。样品材料被吸入外径为650μm和内径为300μm的铜毛细管中。然后将该毛细管装入容器中，暴露于2100巴的压力下并随后迅速冷冻(典型地＞600K/s)到165K温度或更低。

现有技术方法是通过将带有毛细管和样品材料的容器浸入液氮(LN₂)中，将毛细管从容器移除，并将毛细管转移到低温超薄切片机进行的。在低温超薄切片机中，毛细管材料被移除并且样品材料被切片制成样品。

应指出还已知在冷冻温度下将样品切片，接着是冷冻-置换步骤，然后是在室温下的荧光标记步骤，接着是在室温下观测(inspection)。见M.Karreman等，“VIS2FIX：A High-Speed Fixation Method for Immuno-Electron Microscopy”，Traffic，第12卷，2011年7月发行，第806-814页，另称为Karreman[-2-]。

已知对样品的机械切割引入了制品(artifact)，见例如“An oscillating cryo-knife reduces cutting-induced deformation of vitreous ultrathin sections”，A.Al-Amoudi等，J.Microsc.2003(十月)，212(Ptl)，26-33页，另称为A1-Amoudi[-3-]。这些制品是由样品材料上的机械力产生的。因此，近来使用聚焦离子束(FIB)加工对样品材料进行切片，其中材料被聚焦离子束切削(mill)(溅射分开)，例如能量在10到40keV之间的鎵离子束。FIB切片实现了无力(forceless)切割。

对毛细管进行FIB切片的一个缺点是毛细管的铜或钢的切削速度比生物材料更低。而且，壁厚度与样品材料芯的直径相比是相当大的。这表明大量的毛细管材料必须以低切削速度移除以形成样品材料切片(样品，也称为薄片)。低的切削速度和相对大的材料量造成了长的产出时间(throughput time)。

需要由毛细管制作样品而不在样品材料上施加力且具有比现有技术方法更快的产出时间。

发明内容

本发明旨在提供上述问题的解决方案。