[发明专利]一种筛选乳腺癌干细胞的三维培养方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种筛选乳腺癌干细胞的三维培养方法。

背景技术

乳腺癌是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。在我国，乳腺癌的发病呈明显上升趋势，目前已成为女性最常见的恶性肿瘤。有学者认为肿瘤干细胞的存在是恶性肿瘤的根源所在。多年的治疗研究显示，乳腺癌干细胞在放疗中的抗药性和药物排除能力、化疗过程中的抵御辐射等行为以及术后的复发和转移仍是其治疗方面较棘手的问题。因此，亟需研发出合适的筛选方法以有效筛选出乳腺癌干细胞，从而用以乳腺癌发病机制和生物治疗等方面的研究。

现有技术主要采用流式细胞仪分选或免疫磁珠分选的方法分离乳腺癌肿瘤干细胞，其成本较高，流程繁琐，而且获得的细胞活力差，后续培养及研究难度大。

研究发现，肿瘤干细胞具有某些独特的特点，这有助于在体外培养中形成形态各异的细胞群落。如人神经胶质瘤细胞系U251的一小部分细胞在培养中能形成紧凑、圆形的群落，这些群落中的大多数细胞都具有自我更新的能力，可以形成肿瘤球，而且可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。乳腺癌干细胞具有多个亚群，学者们推测其亦有独特的结构特点。在体外培养中，这些特性或许可以使得乳腺癌干细胞形成形态各异的细胞群落。Ponti等（Ponti D, et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Res,2005,65:5506-5511.）研究发现，从3例乳腺癌组织和一个确定的乳腺癌细胞系中取出细胞进行体外培养，可得到不黏附的肿瘤细胞球，这些细胞球中有些细胞具有自我更新和不断增殖能力的未分化细胞。该研究提示，这种体外培养模型可作为获得乳腺癌干细胞的方法之一。

三维细胞培养技术是将细胞种植在一定的细胞外基质中，细胞外基质充当生长支架，使得细胞能够分化产生一定的三维组织特异性结构。在组织形成、血管发育和器官再造等发育生物学的分支领域，三维细胞培养技术得到了广泛的应用。许多研究发现，体外三维的培养环境比二维的培养环境更有利于细胞功能的保持和发挥。研究表明，三维细胞培养系统能够有效地促进造血干细胞的活性，在无细胞因子存在时仍能够保持造血干细胞长期存活增加细胞数量，增强细胞分裂能力。考虑到生物支架材料——胶原在干细胞体外大规模培养领域的应用，如果把乳腺癌细胞接种在由胶原制成的三维支架材料中进行培养，将会成为一个更有效的乳腺癌干细胞培养方式。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种筛选乳腺癌干细胞的三维培养方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种筛选乳腺癌干细胞的三维培养方法，包括如下步骤：

1)        获得单细胞状态的人乳腺癌细胞，加入完全培养基中，制成细胞悬液，细胞密度调整至1×10⁴～1×10⁵个/mL； 

2)        将鲑鱼凝血酶加入细胞悬液，使凝血酶的浓度为1～4U/mL，混合均匀，得到混合液A，冰浴备用；

3)        用完全培养基将鲑鱼胶原蛋白原稀释至1.5～3mg/mL，得到混合液B，冰浴备用；

4)        将混合液A与混合液B等体积混匀，得到混合液C，接种至细胞培养板，36～38℃下保温，使其凝固成软凝胶； 

5)        在软凝胶上方加入体积为混合液C1～2倍的完全培养基，置于细胞培养箱内培养，每2～4天更换培养基一次；

6)        培养至9～11天，即得到乳腺癌干细胞微球。

优选的，步骤1）中使用的人乳腺癌细胞为MCF-7。

优选的，所述完全培养基为添加有10～15v/v%胎牛血清、80～150U/ml青霉素和80～150mg/ml链霉素的高糖DMEM培养基。

优选的，步骤2）中，混合液A中鲑鱼凝血酶的浓度为4U/mL。

优选的，步骤3）中，混合液B中鲑鱼纤维蛋白原的浓度为2mg/mL。

优选的，步骤5）中，培养条件为：37.0～37.5℃，4.9～5.1%CO₂，饱和湿度。

本发明的有益效果是：