[发明专利]原核细胞中高效表达有活性的细胞周期检测点激酶2及其分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组蛋白酶，尤其涉及一种原核细胞中高效表达有活性的细胞周期检测点激酶2的方法，属于重组蛋白酶领域。

背景技术

癌症是威胁人民健康，危及人民生命的严重疾病，亦称恶性肿瘤(malignant neoplasm)，为由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病。癌细胞除了生长失控外，还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分。癌症的治疗方法：手术治疗，放射治疗，化学疗法，靶向治疗等。肿瘤分子靶向治疗常用的治疗靶点：细胞受体、信号传导和抗血管生成等。此类药物主要有两类，小分子化合物和单克隆抗体，小分子化合物常用的有：Glivec(STI51，格列卫)、Iressa(ZD1839，Gefitinib，易瑞沙)、Erlotinib(Tarceva，OSI-774，特罗凯)、Sorafenib(索拉非尼，多吉美)、Sunitinib(Sutent，SU11248，舒尼替尼)、Lapatinib(拉帕替尼)、Vandetanib(凡德他尼)、Dasatinib(达沙替尼)等；单抗类分子靶向药物常用的有：Herceptin(Trastuzumab，贺赛汀)、Rituximab(美罗华)、IMC-C225(cetuximab，Erbitux，爱必妥)和Bevacizumab(Avastin，阿瓦斯汀)等。

CHK2是近年来新发现的一个细胞周期调控蛋白。在发生DNA损伤或复制阻滞后，细胞通过不同途径激活CHK2，进而作用于下游不同的靶蛋白，最终激活G1、S和(或)G2/M期检测点机制，使细胞周期进程发生阻滞，同时激活修复相关基因的转录，促进细胞对损伤进行修复。由于CHK2在细胞周期中具有重要的负调控作用，许多学者认为CHK2起着抑癌基因的作用，它的异常会导致细胞周期检测点对DNA损伤或复制阻滞不能发挥正常功能，从而引起肿瘤易感性增加，最终导致肿瘤的发生或发展。

调控细胞周期是抗肿瘤药物研究的热点之一，目前研究认为细胞周期检测点途径主要由ATM(ataxia telangiectasia mutant)、ATR-Chk1/2一Cdc25A、Cdc25B、Cdc25C轴组成，Chk2属于丝氨酸/苏氨酸激酶，是ATM(ataxia-telangiectasia mutated，共济失调毛细血管扩张症突变基因)及ATM相关基因的下游效应基因，位于细胞周期检测点激活途径的终端，是细胞周期检测中最关键的效应蛋白激酶。因此细胞周期检测点激酶(checkpoint kinase)CHK2，在药物、电离辐射(IR)和紫外线(UV)等引起DNA损伤后被ATM和ATR磷酸化激活，在S期和G2期检测点调节中发挥重要作用[Rouse J，Jackson SP.Interfaces between the detection，signaling，and repair of DNA damage[J].Science，2002，297(5581)：547-551]，是肿瘤治疗放化疗增敏的新靶点。CHK2基因位于染色体22q12.1。包含14个外显子，其cDNA全长为2061bp。编码蛋白为514个氨基酸，分子量60kD；CHK2mRNA在正常组织中广泛存在，其蛋白在整个细胞周期中稳定表达，在没有DNA损伤时大部分处于失活状态，在DNA损伤(尤其DNA双链断裂，DSB)后，通过CHK2分子寡聚化和自动磷酸化而激活[Matsuoka S，Huang M，Elledge SJ.Linkage of ATM to cell cycle regulation by the Chk2protein kinase[J].Science，1998，282(5395)：1893-1897]。CHK2也不影响体细胞正常生长.正常胚胎发育和干细胞生长也不需要CHK2.但Takai[Takai H，Naka K，Okada Y，et al.Chk2-defieient mice exhibit radioresistanee and defective p53-mediated transeription[J].EMBO J，2002，21(19)：5195-5205]等发现CHK2(-/-)鼠由于脾淋巴细胞保存而对放射线抗拒。DNA损伤(尤其DSB)后，CHK2激酶主要由ATM激活；这也是IR引起CHK2激活的主要路径。IR照射后ATM首先磷酸化CHK2FHA区域中第68位苏氨酸(T68)，随后位于激酶活性区内的T383和T387自动磷酸化，使CHK2激酶激活；低剂量(0.25Gy)照射后DSB产生少、只引起CHK2-T68磷酸化，≥1Gy照射后产生的DSB较多、才可引起CHK2-T387自动磷酸化而激活激酶[Buscemi G，Perego P，Carenini N，et al.Activation of ATM and Chk2 kinases in relation to the amount of DNA strand breaks[J]，Oncogene，2004，23(46)：7691-7700]。照射后CHK2-T68磷酸化是激酶自动磷酸化激活所必需，CHK2-T68磷酸化后才可与DNA损伤部位结合，CHK2激酶活性以及核内位点形成数目与DNA损伤严重程度有关，并随着DNA断裂双链的重接而逐渐减弱[Ward IM，Wu X，Chen J，et al.Threonine68 of Chk2 is phosphorylated at sites of DNA strand breaks[J].J Biol Chem，2001，276(51)：47755-47758]。CHK2-S516也是照射后体内诱导磷酸化位点和体外自动磷酸化位点，细菌、293细胞和CHK2缺乏的鼠胚胎成纤维细胞过度增殖时CHK2可被磷酸化。体内CHK2激酶活性依赖于T383/T387和S516磷酸化。另外，UV和氧过多也经ATM依赖和非依赖方式激活CHK2[Sorensen CS，Syljuasen RG，Falck J，et al.Chk1regulates the S phase check[′oint by coupling the physiological turnover and ionizing radiation.induced accelerated proteolysis of Cdc25A[J].Cancer Cell，2003，3(3)：247-258]。