[发明专利]原核细胞中高效表达有活性的细胞周期检测点激酶2及其分离纯化方法

权利要求书

1.具有CHK2蛋白酶活性的CHK2Kinase Domain蛋白的制备方法，包括将CHK2Kinase Domain蛋白的编码核酸序列与pGEX系列载体可操作性的连接，得到重组表达载体，将该重组表达载体转化到宿主细胞中，然后诱导宿主细胞中CHK2Kinase Domain蛋白的表达，离心收集宿主细胞，超声破碎宿主细胞收集上清，经GST亲和层析和分子筛层析后即得纯化的CHK2Kinase Domain蛋白。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述pGEX系列载体为pGEX-6p-1。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述核酸序列通过EcoRI酶切位点和XhoI酶切位点克隆入pGEX-6p-1。

4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其中所述核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.根据权利要求1任一项所述的制备方法，其中所述宿主细胞为BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)plyss、TransB(DE3)或Transsetta。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其中在所述超声破碎宿主细胞之前还包括高压碎菌步骤，所使用的压力为1200bar。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，所述超声程序为功率200w，超声4秒，间隔6秒，共40个循环。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其中诱导宿主细胞中CHK2Kinase Domain蛋白的表达的方法为：转化宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆在SOC培养基中37℃培养12-16小时，转入LB培养基中至OD600nm≈0.4-0.6，加入1mmol/L IPTG，诱导6h。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述GST亲和层析过程为：先用分子筛缓冲液（133mmol/L Nacl、2.6mmol/L kcl、10.9mmol/L Na2HPO4.12H2O、1.7mmol/L KH2PO4）平衡GST亲和层析柱，然后将上清于4℃上样于GST柱，流速1mL/min，反复上样三次，并收集穿透流出液，上样完成后，用高盐PBS（633mmol/L Nacl、2.6mmol/L kcl、10.9mmol/L Na2HPO4.12H2O、1.7mmol/L KH2PO4）洗脱杂蛋白，再用分子筛缓冲液冲洗以降低盐浓度，再加入proscission蛋白酶4°C切过夜，次日，用分子筛缓冲液冲洗目的蛋白，将目的蛋白用截留分子量为10kD的浓缩管进行离心浓缩。

10.根据权利要求8所述的制备方法，所述离心在4°C3400rpm条件下进行，当浓缩管中溶液为250μL时停止浓缩，加入分子筛缓冲液，重复两次该浓缩过程。

11.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述分子筛层析使用Superdex200凝胶预装柱。